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摘要研究背景：<br>　　巨噬细胞是一类主要的先天免疫细胞，它们存在于各种组织中，是免疫系统哨兵。巨噬细胞表达各种模式识别受体，如Toll样受体和清道夫受体，识别病原微生物并启动和放大免疫反应；或识别宿主凋亡细胞和分泌组织修复因子，参与稳态功能。因此，了解驱动巨噬细胞发育和功能的分子机制对于理解免疫系统至关重要。肺泡巨噬细胞是位于肺泡隔或肺泡腔表面的驻留巨噬细胞，充当呼吸道的主要免疫哨兵，表达特异性表面标记物，如 Siglec-F 和 CD11c，并参与表面活性剂脂质的清除。肺泡巨噬细胞功能障碍与各种肺部疾病相关，如慢性阻塞性肺疾病急性肺损伤、肺纤维化和肺泡蛋白沉积（PAP）。目前，这些肺部疾病的常规治疗策略的有效性有限，而肺泡巨噬细胞靶向策略的应用可能是一种有前途的新治疗方法。全面了解肺泡巨噬细胞的发育途径有助于开发新的肺部疾病治疗方法。<br>　　活化的蛋白激酶 C 受体 1（Receptor for Activated C Kinase 1，RACK1）是信号通路的构架蛋白，通过蛋白-蛋白相互作用调控多条信号通路的活化，在爆发性肝炎，肿瘤，白血病，细胞衰老等研究中都扮演者十分重要的角色。但是RACK1是否影响肺泡巨噬细胞发育，还未见报道。<br>　　研究目的：<br>　　明确 RACK1 对于肺泡巨噬细胞发育影响，探讨 RACK1 调控肺泡巨噬细胞分化发育的作用机制。<br>　　研究方法：<br>　　1.利用课题组前期建立的实验小鼠（Lyz2-Cre+/+: RACK1F/F，简称RACK1△Mye）和对照小鼠（Lyz2-Cre+/+: RACK1F/-，简称 RACK1F/-）；PCR 鉴定小鼠基因型；免疫印迹法验证肺泡巨噬细胞中RACK1的表达情况。如无特殊说明，本研究使用6-8周同窝同性别小鼠。<br>　　2.利用流式细胞术检测 Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠肺实质及肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞数量及比例，和特异性表面标志物平均荧光强度；检测25周龄Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠肺实质中肺泡巨噬细胞数量及比例；利用流式细胞术检测Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠肝脏中巨噬细胞的数量及比例。<br>　　3.给 Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠注射BrdU 后流式细胞术检测肺泡巨噬细胞中正在增殖的细胞比例；地塞米松诱导 Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞24 h 后流式细胞术检测肺泡巨噬细胞中凋亡细胞的比例。<br>　　4.取 Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠肺组织 EVG 染色、肺泡巨噬细胞油红 O 染色后观察其形态变化。<br>　　5.地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡后，再用 CFSE 标记染色。取 Rack1F/- 与 Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞与上述胸腺细胞共孵育 1 h ，流式细胞术检测肺泡巨噬细胞吞噬凋亡细胞的比例。流式细胞术检测 Rack1F/-与 Rack1△Mye 小鼠肺泡灌洗液中中心粒细胞数量及比例。<br>　　6. 以 2∶1 的比例将 Rack1F/- （CD45.1）与 Rack1△Mye 小鼠（CD45.2）的骨髓单个核细胞细胞混合，然后尾静脉过继转移给致死剂量辐射过CD45.1CD45.2野生型小鼠，9周后流式细胞术检测其肺泡巨噬细胞及肝巨噬细胞的嵌合情况。<br>　　7.分选 Rack1F/-小鼠与 Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞进行高通量转录组测序，分析差异表达基因和富集的通路。<br>　　8.分离 Rack1F/-小鼠与 Rack1△Mye 小鼠骨髓单个核细胞，用 GM-CSF和PPAR-γ 激动剂先后诱导，体外培养 AM-like 细胞，流式细胞术检测 AM-like 细胞的数量及比例，和表面标志物的平均荧光强度。<br>　　9.蛋白印迹法检测 Rack1F/-小鼠与 Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞、骨髓来源细胞培养的 AM-like 细胞中 PPAR-γ的蛋白表达量；在 293T 细胞中共表达相同浓度 PPAR-γ 和不同浓度 RACK1 后检测 PPAR-γ蛋白表达量。<br>　　10.蛋白印迹-免疫沉淀法检测 RACK1 是否影响 PPAR-γ的半衰期 RACK1是否调控 PPAR-γ 的泛素化修饰作用；免疫荧光鉴定 PPAR-γ与 RACK1 是否存在相互作用；免疫荧光鉴定 PPAR-γ与 RACK1 是否存在共定位；RACK1 是否影响 PPAR-γ 与 E3 连接酶 MDM2 的相互作用。<br>　　研究结果：<br>　　Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞的数量及比例显著低于同龄、同性别对照小鼠，且肝脏及其他组织巨噬细胞数量及比例没有明显变化；Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞形态发生改变，胞质中有脂滴聚集，且在肺组织切片中有泡沫样巨噬细胞出现；Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能降低，且肺泡灌洗液中有中性粒细胞聚集；嵌合小鼠的肺泡巨噬细胞几乎全部来自 Rack1F/-小鼠；Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞转录组特征发生改变，差异表达基因包括肺泡巨噬细胞标记基因，富集的通路包括 PPAR 信号途径；Rack1△Mye 小鼠肺泡巨噬细胞及骨髓来源的 AM-like 细胞的 PPAR-γ 蛋白量降低；RACK1 影响 PPAR-γ 的半衰期；RACK1 与 PPAR-γ 存在內源与外源相互作用；RACK1 通过影响 E3 连接酶 MDM2 与 PPAR-γ 的相互作用调控其泛素化修饰。<br>　　研究结论：<br>　　以上结果表明 RACK1 通过结合并稳定 PPAR-γ，改变其蛋白表达量，从而特异性调控肺泡巨噬细胞的数量、形态、功能及转录组特征。