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摘要蛋白质糖基化修饰是真核细胞重要且结构多样的翻译后修饰形式之一，主要包括O-连接糖基化、N-连接糖基化和GPI锚定糖基化。蛋白质糖基化修饰在细胞-细胞相互作用信号识别、炎症与免疫反应、肿瘤等重大疾病发生发展中发挥重要作用。O-连接N乙酰半乳糖氨（O-GalNAc）糖基化，由多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶（ppGalNAc-Ts）家族蛋白催化起始，将GalNAc基团以糖苷键与底物蛋白丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基上羟基O原子相连，生成Tn抗原结构（O-GalNAc-Ser/Thr）。ppGalNAc-Ts酶家族由20余种同工酶组成，其组织分布及底物选择特异性均不相同。本实验室在前期研究中发现转化生长因子受体TβRⅡ和骨形态发生蛋白受体BMPR1A可分别作为ppGalNAc-T4和T8酶的底物进行O-GalNAc糖基化，O-GalNAc糖基化通过影响下游通路活性参与乳腺癌细胞表型调控。然而，ppGaNAc-Ts酶的酶学性质和新底物尚待进一步研究。<br>　　本研究旨在体外建立ppGalNAc-T2和T4酶催化底物O-GalNAc糖基化的反应体系，以此为工具发现ppGalNAc-T2和T4酶新底物，进一步对底物糖基化位点和催化酶动力学参数进行分析，获得结果如下：<br>　　（1）体外建立ppGalNAc-T2/-T4酶催化底物O-GalNAc糖基化的反应体系。将真核表达人源ppGalNAc-T2或T4酶的分泌型表达载体pFLAG-CMV-3-T2或pFLAG-CMV-3-T4转染至HEK293T细胞，收集上清液，利用anti-FLAG偶联凝胶beads亲和层析纯化，获得重组表达的ppGalNAc-T2和T4酶。以FAM荧光标记的EA2肽段为受体底物，以UDP-GalNAc为底物糖供体，构建ppGalNAc-Ts酶体外酶活反应体系，高效液相色谱（HPLC）分析结果显示纯化的ppGalNAc-T2和T4酶具有良好酶活性，可用于新底物的发现。<br>　　（2）体外反应体系ppGalNAc-T2/-T4酶新底物的发现。合成TβRI和BMPR1A来源的包含Ser/Thr肽段，利用ppGalNAc-T2和T4在体外反应，HPLC法鉴定酶催化反应产物。结果显示，含有TβRI来源肽段的ppGalNAc-T2/-T4酶催化反应体系无法检测到产物峰。BMPR1A来源（aa：131-142）肽段经ppGalNAc-T2/-T4酶催化，在 HPLC中获得明显产物峰，提示 BMPR1A来源肽段是ppGalNAc-T2/-T4酶的体外反应新底物。经液相-质谱联用（LC-MS/MS）证实， ppGalNAc-T2和T4酶均可催化BMPR1A来源肽段发生O-GalNAc糖基化，且糖基化位点同为BMPR1A的137位Thr残基。<br>　　（3）ppGalNAc-T2/-T4催化BMPR1A来源肽段的酶动力学分析。使用HPLC法检测底物BMPR1A来源肽段的米氏常数。结果显示，ppGalNAc-T2和T4的催化底物肽段的 Km值分别为30.93μM和13.08μM， Vmax分别为188.6μmol/min/μg和1.344μmol/min/μg，Kcat分别为2694/min和17.92/min。这些结果提示，ppGalNAc-T4酶对BMPR1A来源肽段具有更高亲和力，而ppGalNAc-T2酶对BMPR1A来源肽段具有更高催化效率，提示这两种酶对该底物具有不同的选择性。<br>　　以上结果表明，BMPR1A是人源ppGalNAc-T2/-T4酶的体外反应的新底物， Thr137为BMPR1A潜在的O-GalNAc糖基化位点。对于新底物BMPR1A来源肽段，ppGalNAc-T2和T4具有不同的酶动力学性质。这些结果为揭示在生理条件下BMPR1A的O-GalNAc修饰的机制及生物学功能提供理论和实验基础。