检索历史 清除

摘要抑郁症是一类以精力丧失、兴趣缺失、情绪低迷等为主要临床表现的精神类疾病，对患者的生活质量造成严重的影响，现已成为世界医疗及卫生系统重点关注的问题之一。舍曲林是一类5’-羟色胺再摄取抑制剂类抗抑郁药，是用于抑郁症治疗的五大药物之一，更是广泛应用于青少年及孕哺乳期患者的一类抗抑郁药物，为世界范围内抑郁症治疗提供了有效的药物支撑。舍曲林是一种手性药物，其化学结构中存在两处手性中心，为其药物纯体制备带来了挑战，现有的化学合成方式主要是依靠于不对称合成方式避免异构体的产生，或对产生的异构体进行分离获得药物纯体。但现有的不对称合成工艺繁琐，经济效益较低。<br>　　（4S）-四氢萘酮是舍曲林合成过程中的关键中间体，获得的（4S）-四氢萘酮纯体可通过简单的甲胺还原步骤生成药物舍曲林，避免了立体选择合成的困难。但现有的（4S）-四氢萘酮纯体的获得方式主要是通过液相色谱分离，效率较低。因此，一种更为简单且环保的合成及分离方式仍需进一步探索。<br>　　在以往的异构体合成或分离中，酶材料由于其天然的立体选择性，被发现是一种优异的方案。一种来自于海洋海绵假弧菌的ω-转氨酶（P-ω-TA）由于其特异的远端手性中心选择能力，对于（4S）-四氢萘酮具有良好的拆分能力。经P-ω-TA拆分后的（4S）-四氢萘酮纯体可经简单的还原步骤生成药物舍曲林，避免了复杂的立体选择控制合成步骤。这一简便方案使得P-ω-TA成为抗抑郁药物舍曲林合成的潜在途径。但是生物酶的制备过程复杂、且制备的酶稳定性较差、无法进行回收利用，使得酶材料的使用受制于高昂生产成本。固定化是一种很好的解决途径，以往固定化途径使用的材料由于其非精细的固定化方案使固定化后的酶常常活性受限。<br>　　本研究依据原理为T4噬菌体衣壳与附加衣壳蛋白之间存在高生物亲和力，探索了一种以T4噬菌体衣壳为生物固定化材料的P-ω-TA固定化方式。T4噬菌体衣壳上的Soc蛋白为附加蛋白，本研究通过无缝克隆技术将Soc基因与P-ω-TA基因实现融合，对融合成功的基因序列进行表达。以（S）-α-甲基苄胺为底物监测融合前后酶活是否发生改变。通过自组装技术将重组表达的融合蛋白固定在T4噬菌体衣壳的Soc结合位点。建立酶活回收体系，进行五组酶活回收测试，确定组装后的固定化酶是否能够满足回收再利用的要求。并以α-甲基苄胺消旋体作为拆分能力测试底物，测试固定后酶的（S）-型拆分性能。同时对于固定酶的（4S）-四氢萘酮的胺基化底物拆分能力进行了测定。在本实验中Soc-P-ω-TA蛋白被成功地表达纯化，其产率为3mg/L，并在T4衣壳上实现了P-ω-TA酶的固定化，其拷贝数为674拷贝，结合效率较高。研究发现重组融合前后的酶具有相同的催化活性，在5次催化回收后，平均每轮的酶活回收率＞93%。且经固定化酶的对于（4S）-四氢萘酮的具备原始的转氨催化合成能力，可成功催化脱氨成为舍曲林的合成关键中间体（4S）-四氢萘酮。<br>　　本研究成功地建立了以T4噬菌体衣壳为生物固定化载体的P-ω-TA固定化模型，重组前后的酶活并无发生明显改变，固定后的酶活回收效果良好，且仍保持优秀的拆分性能及（4S）-四氢萘酮催化合成性能，可以满足P-ω-TA酶回收再利用的需求，可提高（4S）-四氢萘酮纯化制备效率，简化舍曲林的合成工艺，有望实现其在工业应用中的价值，并为后续的酶固定化技术提供了可供参考的范例。