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摘要动静脉内瘘（AVF）通畅是血液透析患者顺利进行透析的必备条件，而内膜增生狭窄导致的血管通路功能障碍是患者死亡率增加的重要因素，目前临床上缺乏有效的防治手段。因此，如何防治 AVF 内膜增生狭窄并提高通畅率是近年来血液净化领域的热点及难点。在基础研究领域，有关 AVF 内膜增生机制的研究日渐增多，但尚未有防治 AVF 狭窄的科学、有效的手段。究其原因在于缺乏特异性靶点、针对性的干预药物和有限的临床用药方式等。迄今为止，针对血管内皮细胞及血管平滑肌细胞增生的干预治疗未完全缓解内膜狭窄。而血管外膜内具有分化功能的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs），可能参与血管重塑的过程，但具体机制仍缺乏清晰认识，需要进一步探究MSCs在血管重塑过程中相关分子调控机制。<br>　　GDF-8（growth differentiation factor 8），又称 Myostatin，是 TGF-β 超家族成员之一，主要由骨骼肌细胞合成分泌，CKD 状态下其表达上调，可促进骨骼肌纤维降解。近年来研究发现，GDF-8在心血管疾病、慢性肾脏病（CKD）、慢性恶质病等多种衰老及代谢相关性疾病中发挥重要调控作用。然而，GDF-8在CKD的AVF内膜增生狭窄中的作用尚未有研究，需进一步探究其相关分子调控模式，特别是对MSCs活化增殖的调控模式。<br>　　研究目的：<br>　　探究GDF-8在MSCs增生活化及血管重塑中的作用机制，并进一步探索GDF-8调控YAP信号在AVF内膜增生狭窄中的作用。<br>　　研究方法：<br>　　首先，利用体外细胞培养及野生型小鼠，外源性给予 GDF-8，观察 MSCs 活化增殖及小鼠的肌肉及血管外膜病变情况。进一步建立 5/6次全肾脏切除 CKD小鼠模型，并行颈动脉-颈外静脉端侧吻合术构建动静脉内瘘，进而皮下注射 GDF-8拮抗剂，观察其对 CKD AVF内膜增生狭窄的影响。通过 MSCs培养及刺激实验、免疫荧光染色、蛋白印迹等检测技术观察GDF-8活化下YAP信号表达、MSCs活化及其分子机制。最后，将本课题组研制的活性氧（ROS）敏感负载YAP抑制剂的聚磷酸酯材料（TK-hbPPE）凝胶包裹于 AVF 吻合口周围，利用近红外光局部照射，促进药物释放，实现可控、远程、靶向抑制外膜 MSCs YAP 信号通路，观察该载药体系在防治 AVF 内膜增生狭窄的作用。<br>　　研究结果：<br>　　一、GDF-8刺激血管外周间充质细胞活化及增殖<br>　　1.CKD 小鼠较正常小鼠体重减轻，骨骼肌质量下降，肌纤维面积变小，肌纤维细胞内GDF-8蛋白表达增加；CKD小鼠主动脉血管外膜胶原纤维沉积较正常小鼠增多，血管外膜细胞增殖活跃。<br>　　2.正常小鼠给予外源性 GDF-8后出现 CKD状态下相似的效应，即体重减轻，骨骼肌重量下降，肌纤维横截面面积减少；GDF-8注射后的主动脉血管外膜的ECM沉积加剧，如胶原蛋白Ⅲ，且血管外膜PDGFRα阳性的 MSCs增生活跃，MSCs的 YAP蛋白表达增加；在非 CKD-AVF 模型中，GDF-8 处理后 AVF 的管腔变窄，内膜增厚，AVF外膜胶原纤维蛋白加重，同时PDGFRα阳性的MSCs共染的增殖蛋白（Ki-67）增加，提示GDF-8处理后促进AVF血管外膜MSCs增殖活化。<br>　　3.在体外实验中，使用 GDF-8刺激 MSCs后，MSCs的 Fibronectin（Fn）及 αSMA表达增加，YAP及其下游蛋白CTGF表达增加，GDF-8拮抗剂ATA842能够减弱上述效应；ATA842不能抑制GDF-8同家族TGF-β1对MSCs的刺激作用。<br>　　二、GDF-8 促进慢性肾脏病动静脉内瘘内膜增生狭窄<br>　　体外注射GDF-8拮抗剂ATA842能够改善CKD小鼠体重减轻及肌肉萎缩，降低肌纤维细胞的GDF-8表达；同时，缓解CKD小鼠AVF的新生内膜形成，减轻AVF血管外膜 MSCs的活化，降低其增殖和分化能力（Ki-67，YAP和 FSP-1蛋白表达较对照组下降）。<br>　　三、GDF-8激活YAP信号通路促进MSCs活化及增殖的分子机制<br>　　1.在MSCs细胞实验中，转染S6A质粒过表达YAP蛋白后，出现Fn，胶原蛋白Ⅰ，αSMA表达上升；相反，敲低YAP后Fn，αSMA及其下游蛋白CTGF表达下降，使用YAP抑制剂 Verteporfin 也得到相似的结果。<br>　　2.在GDF-8刺激下，MSCs的早期反应蛋白pERK1增加，使用ERK1抑制剂U0126或者YAP抑制剂Verteporfin均能抑制αSMA蛋白表达，但Verteporfin不能抑制pERK1表达。SGK1 抑制物与 Verteporfin 的结果相似，即能够抑制 YAP 蛋白，但无法抑制pERK1表达；U0126可同时抑制了SGK1蛋白和YAP蛋白的表达，由此可推断，GDF-8通过 ERK/SGK1通路激活 YAP蛋白表达， 进而活化 MSCs。<br>　　四、载药凝胶体系抑制 MSCs YAP 信号通路对慢性肾脏病动静脉内瘘内膜过度增生的干预效果<br>　　1.在 MSCs 实验中，光照 TKhbPPE/VER@PPP 水凝胶体系后能够成功可控释放Verteporfin，从而抑制了GDF-8刺激下Fn、αSMA、YAP和CTGF表达。<br>　　2.在 CKD+AVF 小鼠模型中，局部光照 TKhbPPE/VER@PPP 水凝胶体系成功释放Verteporfin，AVF外膜 MSCs的 YAP蛋白表达下降，PDGFRα阳性 MSCs数量减少， AVF外膜的Ki-67及αSMA蛋白表达下降，AVF管腔狭窄及内膜增生均得到改善。<br>　　研究结论：<br>　　我们首次发现 CKD状态下骨骼肌合成的 GDF-8与 AVF血管外膜间充质干细胞发生交互作用，参与AVF外膜纤维化及AVF内膜增生的过程，GDF-8激活MSCs的YAP蛋白表达而活化MSCs，促进MSCs增殖、分化和ECM蛋白表达。使用负载Verteporfin的纳米凝胶，光照后成功释放药物可控抑制AVF外膜MSCs的YAP蛋白表达，从而抑制AVF外膜MSCs的活化，减轻AVF内膜增生狭窄，为临床预防和治疗AVF内膜增生狭窄提供潜在策略。