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摘要LncRNA是长度超过200个核苷酸的转录本，被报道可以通过与各种分子相互作用，调节染色质修饰、RNA剪切、基因转录、翻译等，广泛参与细胞增殖、分化、代谢等生物学过程，近年来成为了肿瘤研究的热点。肾癌是一种恶性程度较高的疾病，男性和女性的发病率均居于恶性肿瘤发病率前十位，而死亡率位于泌尿系统三大肿瘤之首，严重影响了民众健康，造成了沉重的社会负担。肾癌与肥胖、糖尿病等代谢因素有关，并且基因组学分析发现常见肾癌基因的突变、失活或过度激活都涉及能量及营养代谢途径失调。肾癌以手术治疗为主，分子靶向治疗为辅，而对放疗及化疗均不敏感，亟待开发新的肿瘤治疗靶点。本课题组着眼于经典的致癌基因PVT1，探索其通过调控肾癌代谢重编程促进恶性进展的机制，可能为日后肾癌的治疗提供新的思路。<br>　　第一部分 PVT1在肾癌组织和细胞中的表达及调控作用<br>　　目的：探究 lncRNA PVT1 在肾癌中的表达及预测价值，明确 PVT1 调控肾癌恶性生物学行为的作用。<br>　　方法：对TCGA数据库中的lncRNA进行分析，比较PVT1在肾癌及癌旁组织中的表达差异，结合数据库中患者临床信息，建立以PVT1表达量为基础的预测模型。通过CCK-8实验、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验、葡萄糖摄取、乳酸产生和ECAR测定明确PVT1对肾癌细胞增殖、迁移和糖酵解能力的影响。<br>　　结果：PVT1 显著高表达于肾癌组织及细胞中，并且高表达 PVT1 的患者 OS、DSS都明显缩短；结合数据库中患者的年龄、性别、TMN分期等临床信息，建立了以PVT1表达量为基础的预测模型，表明PVT1能够预测肾癌患者的OS。敲低PVT1显著抑制肾癌细胞增殖、侵袭、皮下成瘤等能力。RNA测序联合KEGG通路分析结果显示受PVT1调控的基因富集在代谢通路。在转染了干扰PVT1慢病毒以后，786-O和A498细胞对葡萄糖的摄取减少、乳酸产生也减少，并且ECAR值也发生了显著的下降，表明敲低PVT1能够抑制细胞的糖酵解的速率。<br>　　结论：PVT1在肾癌中高表达，且可以作为危险因素预测患者OS。PVT1通过促进肾癌细胞糖酵解影响其增殖、迁移等生物学行为。<br>　　第二部分 PVT1靶向结合 miR-532-3p调控 Wnt信号通路<br>　　目的：研究PVT1通过靶向调控miR-532-3p/BCL9信号轴，激活Wnt信号通路，调控肾癌细胞糖酵解。<br>　　方法：预测能够与PVT1结合的miRNAs，筛选出受PVT1调控的miR-532-3p，并明确miR-532-3p在肾癌中的作用。通过数据库预测联合RNA测序结果，筛选出下游基因 BCL9。qRT-PCR 和western blot 检测在单独转染 sh-PVT1 或联合转染miR-532-3p inhibitor后，细胞中 BCL9 mRNA和蛋白水平的改变，分析 PVT1、miR-532-3p对BCL9的调控作用。探究PVT1通过调控miR-532-3p影响肾癌细胞糖酵解，改变其增殖、迁移的能力。<br>　　结果：在两个在线数据库 starBase v2.0 和 DIANA TOOL中预测能与 PVT1 结合的miRNA，通过基因相关性分析，测定敲低或过表达PVT1后miRNA表达量，确定PVT1 能够负向调控 miR-532-3p。在肾癌细胞中转染 miR-532-3p mimics和inhibitor及对应的阴性对照，验证miR-532-3p能够抑制肾癌细胞的增殖、迁移和糖酵解。使用miRDB、miRWALK和TargetScan三个在线数据库预测miR-532-3的靶基因，结合RNA测序的结果，确定BCL9为研究目标。BCL9是Wnt通路的共激活因子，高表达的 BCL9 能够激活 Wnt 信号转导通路，改变下游基因表达。qRT-PCR和western blot实验发现敲低PVT1能够显著抑制BCL9的表达，在此基础上抑制miR-532-3p的表达，BCL9的mRNA和蛋白水平均出现了一定的回复，并且 Wnt 通路下游的基因 c-Myc 和 cyclin D1 的变化与 BCL9 一致。分别构建不同的荧光素酶报告基因质粒，与 miR-532-3p mimics 共转染，发现野生型 PVT1、野生型 BCL9 质粒均能降低荧光素酶的活性，说明 PVT1、BCL9 与miR-532-3p都存在直接结合。<br>　　结论： PVT1 竞争性地靶向结合 miR-532-3p，上调 BCL9 的表达，激活 Wnt 信号转导通路，导致下游基因转录激活，增强肾癌细胞的糖酵解和增殖、迁移的能力。<br>　　第三部分 PVT1通过 FGFR1/PKM2 调控肾癌细胞糖酵解促进肿瘤进展<br>　　目的：探究PVT1通过结合FGFR1、PKM2蛋白调控肾癌糖酵解的机制。<br>　　方法：构建 PVT1-sense 和 PVT1-antisense 两种探针，进行 RNA pulldown 实验、蛋白质谱分析，筛选出葡萄糖代谢的关键酶PKM2，验证PVT1与PKM2直接结合并对其进行调控。明确PVT1对PKM2的调控需要FGFR1的参与，并进一步探索PVT1通过依赖于FGFR1途径调控PKM2的机制。<br>　　结果：RNA pulldown 后蛋白电泳银染、western blot 和 RIP 实验证实 PVT1 与PKM2 直接结合；但 PVT1 不改变 PKM2 mRNA和总蛋白水平，只影响其蛋白的磷酸化水平。PKM2磷酸化水平增高导致细胞内低丙酮酸激酶活性的二聚体形式PKM2 增多，增强细胞的糖酵解能力。考虑到 lncRNA 无法直接进行蛋白修饰，因此我们寻找了可能参与磷酸化修饰PKM2的蛋白FGFR1。Co-IP证实FGFR1与 PKM2 存在直接结合，而 RNA pulldown 和 RIP 也证实 PVT1 与 FGFR1 存在结合关系，因此猜测PVT1可能是通过调控FGFR1的表达，进而对PKM2进行磷酸化修饰。进一步探索发现，在敲低 PVT1 后，FGFR1 的蛋白泛素化降解增多，稳定性显著降低，导致细胞表达量下降。<br>　　结论：PVT1通过减少FGFR1蛋白泛素化降解，增加其蛋白稳定性及表达；稳定表达的FGFR1通过对PKM2进行磷酸化修饰，使细胞内二聚体形式的PKM2增加，保持低丙酮酸激酶的活性，促进肾癌细胞糖酵解。