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摘要研究背景和目的：<br>　　肾细胞癌（RCC）是起源于肾小管上皮细胞的泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的80%-85%，并且其发病率在过去十年中一直呈上升趋势。根据WHO的数据库，肾细胞癌被认为是全球最常见的上皮性癌症之一，2020年全球有超过43万个新病例和近18万个死亡病例。该病的死亡率和严重程度与晚期诊断有很大关系，因为只有10%的患者出现典型症状，如血尿、背痛或腹部肿块。由于肾细胞癌的异质性，大约20-30%的患者术后容易发生局部复发和远处转移，其中25%诊断为局限性肾细胞癌的患者会发生远处转移。因此，破译肾细胞癌进展和转移的分子机制具有重要的临床意义。<br>　　环状RNA（circRNAs）是一种在许多物种中普遍存在的新发现的非编码RNA（ncRNAs）。与典型的线性RNA不同，circRNAs通过特定的选择性剪切，从外显子或内含子形成一个共价封闭的连续环状结构，既没有5''帽，也没有3''聚腺苷酸尾巴，这使它们比线性RNA更稳定。越来越多的证据表明，circRNAs在包括肾细胞癌、膀胱癌、乳腺癌和肝细胞癌在内的多种恶性肿瘤的发病机制中起着关键作用，有望成为肿瘤诊断、预后评估的生物标记物以及药物治疗的有效靶点。<br>　　转移性肾细胞癌对放射治疗和化学治疗均不敏感，预后差，传统的细胞因子治疗效果也有限。近年来，随着越来越多的免疫检查点抑制剂和靶向药物的应用，转移性肾细胞癌患者的生存得到明显提高。目前的研究表明，虽然靶向治疗对转移性肾细胞癌有一定的疗效，但靶向治疗的效果仍然有限：一方面，靶向药物对患者有明显的毒副作用，另一方面，靶向治疗耐药性的产生。因此，临床上迫切需要研究肾细胞癌的生物学机制，早期识别肾细胞癌的进展和转移机制有助于更准确地开发靶向药物提高肾细胞癌患者的生存率。<br>　　聚（β-氨基）酯（PBAEs）类聚合物分子是一类新合成的高效聚合物基因载体材料。它含有一级、二级和三级胺以及可水解的酯键，使PBAEs复合物有着更高的细胞亲和力和更高的转染效率。此外，PBAEs可以通过改变其亚单位的位置对肿瘤细胞有特定的亲和力，从而避免对周围正常组织的损害。所有这些优点使这一类聚合物成为构建用于肿瘤靶向治疗的聚合物基因传递纳米粒子的理想选择。<br>　　本课题拟通过公共数据库中的测序数据入手，寻找肾细胞癌进展和转移相关的circRNAs；在肾细胞癌组织样本以及肾细胞癌细胞系中检测筛选的circRNA的表达情况，并且评估筛选的circRNA与临床病理变量和预后的关系；体内外功能实验检测筛选的circRNA对肾细胞癌细胞系增殖、迁移和侵袭、肿瘤生长以及肺转移等生物学行为的影响；深入研究circRNA发挥作用的具体分子机制及可能的信号通路；构建相关纳米复合物并探索纳米复合物在体内的治疗效果，为寻找肾细胞的诊断、预后及治疗的分子靶标提供新的方向和理论支持。<br>　　研究方法：<br>　　（1）寻找肾细胞癌进展和转移相关的circRNAs：从基因表达总库（GEO）数据库中获取肾细胞癌相关的circRNA数据集，使用R语言的limma软件对归一化数据进行差异表达分析，以lgFC＞=2和P值＜0.05作为筛选标准，选择差异高表达的circRNA（hsa_circ_0001946（ciRS-7））。<br>　　（2）检测ciRS-7的表达情况以及和临床病理变量和预后的关系：首先进行琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序及使用RNaseR酶和放线菌素D（ActD）处理细胞验证ciRS-7的存在以及稳定性和闭合环状结构，然后通过荧光原位杂交（FISH）实验、结合实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）的细胞核质分离实验明确ciRS-7在肾细胞癌细胞系内的亚定位。收集正常肾小管上皮细胞和肾细胞癌细胞系、85对接受肾切除术肾细胞癌肿瘤组织和相应的相邻正常肾脏组织标本，采用qRT-PCR检测ciRS-7在细胞系、肾细胞癌组织和相邻正常肾脏组织标本中的表达情况。根据ciRS-7表达水平的平均值，将所有患者分为两组（高ciRS-7组和低ciRS-7组），检测ciRS-7表达水平与肾细胞癌患者临床病理变量之间的相关性。Kaplan-Meier生存曲线检测不同ciRS-7表达水平组患者与总生存率（OS）的关系。<br>　　（3）功能实验检测ciRS-7对肾细胞癌细胞系增殖、迁移和侵袭、肿瘤生长以及肺转移等生物学行为的影响：设计三条ciRS-7特异性小干扰RNA（si-ciRS-7#1、si-ciRS-7#2和si-ciRS-7#3）以及ciRS-7过表达慢病毒，通过转染试剂感染肾细胞癌786-O和ACHN细胞系。采用qRT-PCR和FISH实验检测小干扰RNA和过表达慢病毒的转染效率；通过EdU细胞增殖实验、CCK-8以及菌落形成实验检测ciRS-7对肾细胞癌细胞增殖能力的影响；通过伤口愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验检测ciRS-7对肾细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响；最后通过转染含ciRS-7干扰序列（si-ciRS-7#2）的稳定低表达ciRS-7的慢病毒（sh-ciRS-7）以及过表达ciRS-7的慢病毒（OE-ciRS-7）的786-O细胞系，接种到免疫缺陷鼠皮下和尾静脉注射，观察实验组与对照组比较皮下成瘤能力以及肺组织转移灶的变化，通过体内实验验证ciRS-7对肾细胞癌肿瘤生长以及肺转移能力的影响。<br>　　（4）深入研究ciRS-7发挥作用的具体分子机制及可能的信号通路：<br>　　1.寻找ciRS-7下游miRNA（miR-139-3p）：首先通过生物信息学软件预测ciRS-7可能相关的miRNA以及结合位点，并且根据数据库中表达水平筛选出目的miRNA（miR-139-3p）。通过双荧光素酶报告基因实验、RNApull-down实验以及FISH实验验证ciRS-7与miR-139-3p的直接靶向结合，并且在组织样本以及TCGA数据库中检测miR-139-3p的表达情况和OS关系，以及ciRS-7与miR-139-3p的相关性。通过qRT-PCR验证786-O和ACHN细胞系中过表达和敲低ciRS-7后对miR-139-3p表达水平的影响。<br>　　2.功能实验检测miR-139-3p对肾细胞癌细胞系增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响：通过EdU细胞增殖实验、CCK-8以及菌落形成实验检测miR-139-3p对肾细胞癌细胞增殖能力的影响；通过伤口愈合实验、Transwell迁移、侵袭实验检测miR-139-3p对肾细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。<br>　　3.寻找ciRS-7下游靶基因（TAGLN）以及信号通路（PI3K/AKT信号通路）：首先在转录水平上对sh-ciRS-7和sh-NC细胞系进行转录组测序，并且在蛋白水平上进行验证，筛选出ciRS-7的靶基因（TAGLN）。生物信息学软件预测miR-139-3p与TAGLN的结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-3p与TAGLN直接靶向结合。京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析筛选出下游可能的信号通路（PI3K/AKT信号通路），并进一步应用Western-blot方法检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化。挽救实验检验过表达ciRS-7后升高miR-139-3p的表达对肾细胞癌细胞系增殖、迁移和侵袭生物学行为的影响以及下游TAGLN、PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化；敲低ciRS-7后降低miR-139-3p的表达对肾细胞癌细胞系增殖、迁移和侵袭生物学行为的影响以及下游TAGLN、PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化。<br>　　（5）构建相关纳米复合物（PBAE/si-ciRS-7）并探索纳米复合物在体内的治疗效果:根据PBAE和si-ciRS-7的重量比，制备不同比例的纳米复合物。粒径、聚合物分散性指数（PDI）检测和琼脂糖凝胶电泳检测最佳的PBAE和si-ciRS-7的重量比以及siRNA包封率。透射电镜（TEM）、粒径电位仪检测PBAE/si-ciRS-7纳米复合物的粒径大小。CCK-8实验检测PBAE/si-ciRS-7纳米复合物对肾细胞癌细胞增殖能力的影响；将过表达ciRS-7的慢病毒（OE-ciRS-7）的786-O细胞系接种到免疫缺陷鼠皮下和尾静脉注射，观察不同处理组（生理盐水、动物用si-ciRS-7和PBAE/si-ciRS-7纳米复合物）皮下成瘤能力以及肺组织转移灶的变化，体内实验验证PBAE/si-ciRS-7纳米复合物对肾细胞癌肿瘤生长以及肺转移能力的影响。<br>　　研究结果：<br>　　（1）ciRS-7与肾细胞癌进展和转移相关：根据筛选标准，在GSE100186、GSE108735和GSE137836数据集中分别发现了743、110和210个上调的circRNAs，Venn图显示只有2个与肾细胞癌进展和转移相关的circRNAs（hsa_circ_0001946和hsa_circ_0002484），确定hsa_circ_0001946（ciRS-7）为本研究对象。<br>　　（2）ciRS-7在肾细胞癌组织和细胞系中高表达，并且与不良预后相关：琼脂糖凝胶电泳验证了在786-O、Caki-1、769-P和ACHN细胞系中ciRS-7存在；Sanger测序证实了ciRS-7是由CDR1反向剪切形成的共价闭合的连续环；RNaseR酶和ActD实验验证了ciRS-7具有很好的稳定性。FISH实验和细胞核质分离实验证实ciRS-7主要分布在细胞质中。通过qRT-PCR实验证实相对于正常肾小管上皮细胞和正常肾脏组织，ciRS-7在肾细胞癌细胞系和肿瘤组织中高表达，并且ciRS-7的高表达与肿瘤大小和Fuhrman分级相关。Kaplan-Meier生存分析显示，ciRS-7高表达与不良生存相关，多变量Cox回归分析显示，ciRS-7高表达是肾细胞癌患者的不良预后危险因素。<br>　　（3）ciRS-7在体内外促进肾细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭、肿瘤生长以及肺转移：qRT-PCR和FISH实验检测发现，在786-O和ACHN细胞株中，si-ciRS-7#2可以显著降低ciRS-7的表达，OE-ciRS-7可以显著增加ciRS-7的表达；EdU细胞增殖实验、CCK-8以及菌落形成实验证实与对照组相比，转染si-ciRS-7#2的786-O和ACHN细胞株增殖能力显著降低，转染OE-ciRS-7的786-O和ACHN细胞株增殖能力显著增强；伤口愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验显示转染si-ciRS-7#2的786-O和ACHN细胞株迁移和侵袭能力显著降低，转染OE-ciRS-7的786-O和ACHN细胞株迁移和侵袭能力显著增强。皮下成瘤模型以及肺转移模型显示降低ciRS-7的表达可以显著抑制皮下瘤体的生长和肺转移能力，提高ciRS-7的表达可以显著增强皮下瘤体的生长和肺转移能力。<br>　　（4）1.miR-139-3p是ciRS-7的下游miRNA：通过circBank、circAtlas、miRanda和RNAhybrid软件预测出两个ciRS-7可能相关的miRNA（miR-7-5p和miR-139-3p），TCGA数据库中miR-7-5p在肾细胞癌组织中高表达，而miR-139-3p低表达，确定miR-139-3p为目标miRNA。生物信息学软件预测ciRS-7与miR-139-3p可能有三个结合位点，双荧光素酶报告基因检测显示miR-139-3pmimics可以与野生型的ciRS-7第三个结合位点直接结合抑制报告基因的荧光活性，但不能降低突变型ciRS-7报告基因的荧光活性。RNApull-down实验发现与对照组相比，miR-139-3p可以下拉更多的ciRS-7，并且FISH实验发现ciRS-7和miR-139-3p共定位于细胞质中。此外，qRT-PCR检测发现在85对组织样本中，ciRS-7与miR-139-3p表达呈负相关。以上实验表明ciRS-7可以直接结合miR-139-3p，miR-139-3p是ciRS-7的下游靶标。<br>　　2.miR-139-3p在体外抑制肾细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭：EdU细胞增殖实验、CCK-8以及菌落形成实验证实与对照组相比，过表达miR-139-3p后786-O和ACHN细胞株增殖能力显著下降，敲低miR-139-3p表达后786-O和ACHN细胞株增殖能力显著增强；伤口愈合实验、Transwell迁移、侵袭实验显示过表达miR-139-3p后786-O和ACHN细胞株迁移和侵袭能力显著下降，敲低miR-139-3p表达后786-O和ACHN细胞株迁移和侵袭能力显著增强。<br>　　3.TAGLN是ciRS-7的靶基因，ciRS-7可以激活PI3K/AKT信号通路：对sh-ciRS-7和sh-NC细胞系进行转录水平测序，发下41个上调的差异表达基因（DEGs）和36个下调的DEGs。此外，在蛋白质水平上检验了sh-ciRS-7和sh-NC细胞系，发现492个蛋白质高表达，555个蛋白质低表达。最终发现TAGLN在转录和蛋白水平上都被下调了。双荧光素酶报告基因实验显示miR-139-3p可以直接结合TAGLN。此外，进一步的KEGG分析显示PI3K/AKT信号通路被明显富集。随后Western-blot检测发现转染sh-ciRS-7或miR-139-3p-mimic可以导致786-O和ACHN细胞中TAGLN、p-AKT和p-PI3K的蛋白水平下降，转染OE-ciRS-7或miR-139-3p-inhibitor后，TAGLN、p-AKT和p-PI3K的蛋白水平增加。Western-blot检测发现miR-139-3p-mimic可以部分抵消OE-ciRS-7带来的TAGLN、p-AKT和p-PI3K的表达增加，而miR-139-3p-inhibitor可以部分挽救sh-ciRS-7抑制的TAGLN、p-AKT和p-PI3K的表达减少。此外，EdU细胞增殖实验、CCK-8、菌落形成实验、伤口愈合实验、Transwell迁移和侵袭试验的结果也发现miR-139-3p-mimic可以部分抵消OE-ciRS-7带来细胞增殖、迁移和侵袭能力的增强，而miR-139-3p-inhibitor可以部分挽救sh-ciRS-7带来细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制。<br>　　（5）PBAE/si-ciRS-7纳米复合物的构建以及体内的治疗效果：根据PBAE和si-ciRS-7的重量比，制备了9种不同比例的纳米复合物。结果发现当PBAE和si-ciRS-7的重量比超过40时，会形成相对均匀的纳米颗粒，而当PBAE/si-ciRS-7为80时，表现出优异的性能。琼脂糖凝胶电泳分析表明，当PBAE与si-ciRS-7的重量比超过80时，PBAE和si-ciRS-7可以有效地凝聚在一起，PBAE的装载效率可以达到98%。进一步的TEM以及粒径电位计显示，PBAE/si-ciRS-7纳米复合物的粒径约为160nm。此外，CCK-8实验表明，PBAE/si-ciRS-7纳米复合物比PBAE和si-ciRS-7具有更强的抑制786-O和ACHN细胞增殖的能力。体内皮下成瘤模型以及肺转移模型结果显示与动物级si-ciRS-7相比，PBAE/si-ciRS-7纳米复合物能更好地抑制肾细胞癌肿瘤的生长和肺转移。<br>　　结论：<br>　　我们首先通过芯片筛选了与肾细胞癌进展和转移相关的circRNAs，并重点研究了ciRS-7在肾细胞癌中的内在机制。我们发现ciRS-7在肾细胞癌肿瘤组织和细胞系中高表达，并与肿瘤大小、高Fuhrman分级和不良预后相关。体内外实验发现消耗ciRS-7能明显抑制肾细胞癌细胞的增殖、侵袭、肿瘤生长和肺转移，而过度表达ciRS-7则有相反的效果。机制上，ciRS-7作为miR-139-3p的"ceRNA"阻止TAGLN的降解，通过PI3K/AKT信号通路促进肾细胞癌的进展和肺转移。此外，miR-139-3p模拟物或抑制剂可以逆转ciRS-7过表达或沉默引起的恶性肿瘤行为的改变。此外，PBAE/si-ciRS-7纳米复合物可以显著抑制RCC体内肿瘤的进展和转移，这可以为相关药物开发提供新的思路。