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摘要目的：<br>　　弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是最常见的恶性淋巴瘤类型。目前，以抗CD20单克隆抗体——利妥昔单抗(Rituximab)为基础的R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)方案是DLBCL患者的一线治疗方案，但仍有约三分之一的患者经历复发、难治。靶向B细胞受体(B-cell receptor, BCR)信号通路的布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase, BTK)抑制剂是目前治疗DLBCL最有前途的小分子抑制剂之一。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACI)可以通过阻断基因表达、抑制肿瘤细胞的生长和调节细胞功能等多个途径来实现抗肿瘤作用，但其单药效力有限。泽布替尼(Zanubrutinib)是新一代BTK抑制剂，相比一代BTK抑制剂，具有更优异的选择性和安全性。早期研究发现细胞表观遗传学的改变会导致肿瘤的进展和耐药的发生，如组蛋白去乙酰化蛋白（HDAC）高表达是导致淋巴瘤耐药和疾病进展的重要原因。Pracinostat是泛HDAC抑制剂，在多种实体瘤和血液肿瘤中显示了一定治疗活性，尤其是与其他小分子抑制剂的双联疗法中取得更好疗效，但在DLBCL中的应用仍然缺少尝试。本研究旨在探索Pracinostat协同泽布替尼治疗DLBCL作用机制研究。<br>　　方法：<br>　　①浓度为0、2.5、5、10、20、40、80和160μM的泽布替尼和浓度为0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000和2000nM的Pracinostat分别处理DLBCL细胞株(包括 ABC型 DLBCL NU-DUL-1和 SU-DHL-2；GCB型 DLBCL SU-DHL-6和 SU-DHL-10)24小时、48小时和72小时。采用CellTiter-Glo法检测细胞增殖活力，并计算半数抑制浓度(IC50)。<br>　　②不同浓度的泽布替尼和Pracinostat联合处理DLBCL细胞株48小时，采用CellTiter-Glo法检测细胞增殖活力，并对比各联合组与单药组经处理后细胞的增殖活力变化。<br>　　③将浓度为0、15.63、31.25、62.5、125、250nM的Pracinostat与浓度为0、5、7.5、10、12.5、15μM的泽布替尼联合处理NU-DUL-1和SU-DHL-6细胞48小时。将浓度为0、15.63、31.25、62.5、125、250nM的Pracinostat分别与浓度为0、5、10、15、20、25μM的泽布替尼联合处理SU-DHL-2细胞48小时；与浓度为0、10、15、20、25、30μM的泽布替尼联合处理SU-DHL-10细胞48小时。采用CellTiter-Glo法检测细胞增殖活力，使用SynergyFinder （ https://synergyfinder.fimm.fi ）选用最高单用药效法(the highest single agent, HSA)模型[1]计算出联合用药的协同指数，大于10表示两种药物之间的相互作用为协同效应。<br>　　④ Annexin V-APC/7-AAD(7-氨基放线菌素 D)染色流式细胞术检测 DLBCL细胞株Control组、泽布替尼组、Pracinostat组和联合组的细胞凋亡情况。Western blot检测DLBCL细胞株在Control组、泽布替尼组、Pracinostat组和联合组的细胞中凋亡相关蛋白 PARP1、Cleaved-PARP1、Caspase 3、Cleaved- Caspase 3、Caspase 8和 Cleaved-Caspase 8的表达情况。<br>　　⑤碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色流式细胞术检测DLBCL细胞株Control组、泽布替尼组、Pracinostat组和联合组的细胞周期变化。<br>　　⑥实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)检测泽布替尼处理DLBCL细胞株24小时后HDAC7 mRNA表达变化，免疫印迹实验(Western blot)检测泽布替尼处理DLBCL细胞株24小时后，HDAC蛋白表达变化。<br>　　⑦Western blot检测Pracinostat处理DLBCL细胞株24小时后，HDAC蛋白表达变化。⑧ qPCR检测DLBCL细胞株在Control组、泽布替尼组、Pracinostat组和联合组中HDAC7 mRNA表达量的变化。Western blot检测DLBCL细胞株在Control组、泽布替尼组、Pracinostat组和联合组中HDAC7及BCL-2蛋白表达量的变化。<br>　　⑨在Balb/c裸鼠皮下建立人源ABC-DLBCL细胞株NU-DUL-1异种移植模型验证泽布替尼与Pracinostat在体内发挥联合抗肿瘤作用。<br>　　⑩对肿瘤组织进行免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色，观察Control组、泽布替尼组、Pracinostat组和联合组中细胞增殖核抗原Ki-67变化；对肿瘤组织进行免疫荧光染色，观察各组凋亡TUNEL染色情况变化。<br>　　结果：<br>　　①泽布替尼与Pracinostat对DLBCL细胞株NU-DUL-1、SU-DHL-2、SU-DHL-6、SU-DHL-10有体外抑制作用，且有明显的时间和剂量依赖性。<br>　　②泽布替尼可以有效增强Pracinostat对DLBCL细胞株的增殖抑制作用。<br>　　③不同浓度梯度的泽布替尼和Pracinostat联合处理DLBCL细胞株48小时后，计算两药在DLBCL细胞株中的SHA协同指数，在NU-DUL-1细胞中为19.553，在SU-DHL-2细胞中为9.187，在SU-DHL-6细胞中为19.392，在SU-DHL-6细胞中为23.894.<br>　　④ 泽布替尼和Pracinostat处理DLBCL细胞株48小时后，流式细胞术凋亡检测相较Control组凋亡细胞比例增加；泽布替尼和Pracinostat联合组，凋亡细胞比例明显比单药组增加（Plt;0.05）。Western blot检测表明DLBCL细胞株在单药组中凋亡蛋白表达量相较Control组增加，联合组凋亡蛋白表达量相较单药组增加。<br>　　⑤泽布替尼和Pracinostat处理DLBCL细胞株48小时，流式细胞术周期检测结果表明泽布替尼组和Pracinostat组G0/G1期细胞比例相较Control组增加；联合组处理细胞株48小时后，G0/G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显降低。<br>　　⑥ qPCR检测结果显示，泽布替尼和 Pracinostat可抑制 DLBCL细胞株中 HDAC7 mRNA的表达量。Western blot检测结果显示，泽布替尼和Pracinostat可抑制DLBCL细胞株中HDAC7蛋白的表达量。<br>　　⑦Western blot检测结果显示，Pracinostat可抑制DLBCL细胞株中HDAC7蛋白的表达量。<br>　　⑧ qPCR检测结果显示， DLBCL细胞株在单药组中HDAC7的mRNA表达量相较Control组降低；联合组中HDAC7 mRNA表达量相较单药组降低。Western blot检结果显示，DLBCL细胞株在单药组中HDAC7和BCL-2蛋白表达量相较Control组降低；联合组中HDAC7和BCL-2蛋白表达量相较单药组降低<br>　　⑨。在人源 ABC-DLBCL 细胞株 NU-DUL-1 异种移植模型中，泽布替尼组与Pracinostat组可在体内发挥抗肿瘤作用（Plt;0.05）；联合用药组相较单药组，具有更明显的抗肿瘤作用（Plt;0.05），说明泽布替尼与Pracinostat可在体内发挥联合抗肿瘤作用。⑩在小鼠瘤块中，计算各组增殖标志物Ki67组织化学染色后平均OD值，单药组瘤块中平均OD值较Control组降低；联合组平均OD值相较单药组降低。计算各组视野内TUNEL凋亡免疫荧光染色后阳性细胞数，单药组凋亡细胞数相较Control组增多；联合组凋亡细胞数相较单药组增多。<br>　　结论：<br>　　① BTK抑制剂泽布替尼和HDAC抑制剂Pracinostat对DLBCL细胞株NU-DUL-1、SU-DHL-2、SU-DHL-6、SU-DHL-10在细胞水平具有明显抑制增殖作用，呈时间和剂量依赖关系。在体外两药联用对DLBCL具有协同效应，协同指数分别为：在NU-DUL-1细胞中为19.553，在SU-DHL-2细胞中为9.187，在SU-DHL-6细胞中为19.392，amp;nbsp;在SU-DHL-6细胞中为23.894。<br>　　② 泽布替尼联合 Pracinostat治疗 DLBCL细胞株通过促进凋亡相关蛋白 PARP1、Caspase 3和Caspase 8发生剪切诱导细胞凋亡。同时，两药联合增强DLBCL细胞周期抑制。<br>　　③泽布替尼可抑制DLBCL细胞株中HDAC7的表达量。且泽布替尼和Pracinostat联合可协同抑制HDAC7的表达，并且通过协同下调BCL-2蛋白表达促进细胞凋亡。<br>　　④泽布替尼和Pracinostat可在DLBCL异种移植模型体内可协同抑制瘤块增长，且协同抑制瘤块内细胞Ki-67表达，增加凋亡细胞比例(TUNEL染色阳性)。