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摘要下呼吸道感染（Lower respiratory tract infection，LRTI）是一种严重危害人类健康的感染性疾病，多发于儿童、老人等免疫力低下人群，且引发感染的病原类型广泛，给临床诊断及治疗带来较大的困难。传统的病原检测方法都存在着如检测周期长、操作繁琐、灵敏度低等不容忽视的问题。当病原体没有得到正确识别的情况下进行经验性用药可能会造成抗生素的滥用，使耐药形势日益严峻。近年来，分子检测技术的快速发展在一定程度上弥补了这些检测方法的不足，但依旧受到检测通量和应用场景的限制。因此，开发一种快速、准确、灵敏、高通量、操作简便的下呼吸道病原检测方法具有重要意义。本研究结合通用不对称 PCR 技术和基因芯片技术，开发了一种用于下呼吸道病原及耐药基因的快速、灵敏、高通量检测方法，其具有良好的检测性能，可应用于临床样本的分析鉴定。主要研究内容及结果如下：<br>　　（1）确定靶标，设计引物和探针<br>　　根据CHINET中国细菌耐药监测2021年的统计分析，选择高频出现在呼吸道标本中的6种病原菌和2种碳青霉烯酶基因作为检测目标。根据其特异基因的保守序列设计引物和探针，并设计两段异源序列作为通用引物。对各靶基因进行 PCR 扩增，验证引物的扩增性能。<br>　　（2）制备基因芯片，建立多重PCR检测体系并验证其性能<br>　　将捕获探针点样于环氧基玻片的表面以制备基因芯片，扩增反应分作两步完成，分别是特异性引物介导的PCR 1和通用引物介导的PCR 2。优化不对称PCR的引物浓度比以及杂交反应的参数。使用标准菌株对优化后的检测方法进行性能验证，实验结果显示，大肠埃希菌纯培养物的检测灵敏度分别为 104 CFU/mL、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的检测灵敏度为 103 CFU/mL、碳青霉烯酶基因 blaKPC、blaVIM 的检测灵敏度为 103 copies/mL、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌检测灵敏度为 102 CFU/mL。与产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、唾液链球菌、流感嗜血杆菌等6种病原无交叉反应。该方法特异性强、稳定性好，能在4h内特异性地鉴别单一或多重靶标。<br>　　（3）制备POCT试剂盒，实现全自动封闭检测<br>　　以BoxArray全自动核酸扩增分析系统为设备平台，将通用不对称PCR结合基因芯片的多重检测方法搭载至 BoxArray 的卡盒中。根据优化后的实验条件和设备情况，调整检测程序，通过卡盒内部的移液器将反应液在不同试剂槽之间转移，在封闭的卡盒内部自动完成核酸提取、扩增、杂交和检测的所有实验步骤。该试剂盒检测大肠埃希菌的灵敏度为 104 CFU/mL，检测鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的灵敏度为103 CFU/mL，检测碳青霉烯酶基因blaKPC、blaVIM的灵敏度为103 copies/mL，检测肺炎链球菌和卡他莫拉菌的灵敏度可达 102 CFU/mL。对人工模拟的单一样本和混合感染样本均能检出各靶标且不出现错检漏检。<br>　　（4）临床应用评价<br>　　将本研究建立的方法应用于 24 份临床痰液样本病原检测，并行使用分离培养后的生化鉴定法和单重qPCR法鉴定以评估临床应用效果。结果表明，本研究建立的方法与单重qPCR法的结果完全一致，且阳性率高于分离培养法，具有更高的灵敏度和准确度以及更短的检测周期，适用于多病原的临床快速检测。