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摘要气滞胃痛颗粒组方源于医圣张仲景所著《伤寒论》中的“四逆散”，是临床治疗慢性非萎缩性胃炎的常用中药复方制剂。但由于气滞胃痛颗粒成分复杂，其治疗慢性非萎缩性胃炎的作用机制尚未完全阐明。然而传统的药理学研究方法难以反映中药复方的整体性作用及与机体的交互规律。代谢组学和网络药理学等研究方法与中医学整体观念相一致，符合中药复方多成分、多靶点、多通路的作用特点，因而特别适合中药复杂体系的作用机制研究。<br>　　目的：以气滞胃痛颗粒治疗慢性非萎缩性胃炎为研究对象，采用高分辨质谱结合分子网络可视化分析深层挖掘化学成分信息，关联分析不同种属间代谢组学和网络药理学数据探讨主要活性成分与代谢通路，再利用ELISA方法及分子对接技术验证药效物质基础和作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合非靶向代谢组学方法，以7个代表性柴胡五环三萜皂苷类化合物对照品的质谱裂解规律为基础，经PeakView软件及自建数据库进行匹配，对气滞胃痛颗粒中君药柴胡的化学成分进行定性分析。采用ProgenesisQI和多元统计分析进行数据处理，筛选北柴胡和南柴胡的化学标志物。<br>　　2.采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法对气滞胃痛颗粒的化学成分进行定性分析，获得的质谱数据上传至全球天然产物社会分子网络（GNPS）进行谱库搜索和分子网络分析，对气滞胃痛颗粒中各类化学成分进行鉴定并构建化合物数据库。<br>　　3.结合上述气滞胃痛颗粒化合物数据库，在SwissADME中筛选出OBgt;30%，IG为high的成分作为有效成分，并通过TCMSP数据库、文献挖掘等多种方式检索补充其他化学成分，筛选活性化合物靶点。从GeneCards、OMIM、Disgenet和Drugbank数据库收集疾病相关靶点并校正。采用Cytoscape和STRING软件构建成分-靶点网络及蛋白互作（PPI）网络，寻找核心靶点。将“活性成分-疾病”交集靶点导入Metascape数据库，进行通路注释与富集分析，并预测气滞胃痛颗粒治疗慢性胃炎疾病的作用机制。<br>　　4.采用饥饱失常联合0.1%氨水自由饮用法建造慢性非萎缩性胃炎大鼠模型，通过组织病理切片染色和生化指标检测对模型进行验证并评价药效。收集大鼠血浆和胃组织样本，采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术进行数据采集，采用ProgenesisQI和SIMCA-P14.1软件进行数据处理和分析。以满足VIP＞1，P＜0.05，FC≥1.2或≤0.8为条件筛选差异代谢物。应用在线软件MetaboAnalyst5.0和在线数据库KEGG进行生物富集和代谢通路分析，并利用MetaboAnalyst5.0中的“Joint-PathwayAnalysis”功能模块对代谢组学与网络药理学结果进行关联分析。<br>　　5.按照设定的入选排除标准，招募合格的慢性非萎缩性胃炎患者和健康志愿者，按实验分组给药并收集血浆、尿液和唾液样本，采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术进行数据采集，采用ProgenesisQI和SIMCA-P14.1软件进行数据处理和分析，筛选差异代谢物，并进行代谢物富集分析和潜在生物标志物的代谢通路分析。采用MetaboAnalyst5.0对代谢组学与网络药理学结果进行关联分析，并构建代谢物-基因-蛋白的生物信息网络和蛋白互作网络图。<br>　　6.采用竞争ELISA法定量测定大鼠血浆和胃组织中的花生四烯酸（AA）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酸（LPA）的水平，采用双抗体夹心ELISA法定量分析大鼠前列腺素内的过氧化物合酶1（PTGS1）和过氧化物合酶2（PTGS2）活性。选择核心活性成分槲皮素、山奈酚、陈皮素和甘草查尔酮A为分子对接配体，与选取的核心靶蛋白（PTGS1、PTGS2和LPA2）进行分子对接，对气滞胃痛颗粒治疗慢性非萎缩性胃炎的药效物质基础和作用机制进行验证。<br>　　结果：1.北柴胡和南柴胡药材中共鉴定出131个化学成分，其中35个为首次报道，11个可作为区分二者的化学标志物。2.在气滞胃痛颗粒中鉴定了104个化合物，其中黄酮类36个、生物碱类20个、三萜类12个、单萜苷类10个、酚类10个、香豆素类8个和糖苷类8个。3.筛选得到活性化学成分194个，其中主要活性成分为槲皮素、山奈酚、陈皮素和甘草查尔酮A。慢性胃炎相关靶点267个，药物和疾病共有靶点112个。PPI网络显示潜在核心靶点分别为NPM1，HNRNPK，HSPA5，YWHAZ和HNRNPA1。4.在大鼠血浆样本分析中，发现了14种差异代谢物，其主要代谢通路涉及花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、甾体激素生物合成等。在胃组织样本分析中，发现了29种差异代谢物，其主要代谢通路涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和花生四烯酸代谢等。与血浆样本相比胃组织样本的代谢物表达更为显著。通过与网络药理学结果关联分析发现，两种样本中差异代谢物都集中涉及花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢。5.在患者血浆样本分析中，发现了75种差异代谢物，其主要代谢通路涉及甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路、亚油酸代谢通路和花生四烯酸代谢通路等。在尿液样本分析中，发现了71种差异代谢物，其主要代谢通路涉及鞘脂代谢、精氨酸代谢和酪氨酸代谢等。在唾液样本分析中，发现了32种差异代谢物，其主要代谢通路涉及鞘脂代谢和甘油磷脂代谢通路等。通过网络药理学与慢性非萎缩性胃炎患者代谢组学结果关联分析发现，3种样本中差异代谢物主要代谢通路涉及花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和精氨酸代谢等。综合比较人体与大鼠代谢组学研究，结果表明气滞胃痛颗粒治疗慢性非萎缩性胃炎的主要代谢通路集中涉及花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢。6.在大鼠血浆及胃组织样本中，模型组（CNG组）的AA、PTGS1、PTGS2、PA、LPA水平较空白组（NC组）明显升高（P＜0.01）；而给药组（QZWT组）各指标水平较CNG组明显降低（P＜0.05）。气滞胃痛颗粒的主要活性物质槲皮素、山奈酚、陈皮素、甘草查尔酮A和核心靶点PTGS1、PTGS2和LPA2具有很强的结合活性。<br>　　结论：本研究通过整合分子网络技术、网络药理学方法、非靶向代谢组学方法、ELISA方法及分子对接技术，并运用多种统计分析手段，揭示了气滞胃痛颗粒治疗慢性非萎缩性胃炎的药效物质基础和作用机制，为气滞胃痛颗粒的临床用药提供科学依据，同时为不同种属间差异性研究提供数据支持。本研究为系统研究中药复方制剂多成分、多靶点和多途径的作用机制提供了有价值的实例参考和方法学借鉴。