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摘要第一部分CircMAN1A2表达水平与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征和预后的关系分析<br>　　目的：<br>　　本部分研究旨在探讨circMAN1A2表达水平与食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)患者临床病理特征和预后的相关性，为circRNA作为判断ESCC患者预后的生物标记物提供理论基础。<br>　　方法：<br>　　1.ESCC组织微阵列(HEso-Squ180Sur-08)购自上海芯超生物科技有限公司，相应的ESCC患者临床病理特征和随访资料（患者年龄、性别、T分期、N分期、临床分期、病理分级和整体生存时间）均从上海芯超·生物样本库中获得。<br>　　2.荧光原位杂交法（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）评估ESCC患者组织标本中circMAN1A2的表达。<br>　　3.采用卡方检验对ESCC患者的主要临床病理特征与不同circMAN1A2表达差异进行分析比较。<br>　　4.根据circMAN1A2的变化情况将患者进行分组，采用log-rank检验对患者的总体生存期(OverallSurvival,OS)进行分析，Cox比例风险回归模型分析影响ESCC患者OS的独立危险因素。<br>　　结果：<br>　　1.荧光原位杂交实验分析结果显示，93例ESCC患者组织标本中，circMAN1A2高表达有54例，circMAN1A2低表达有39例。<br>　　2.卡方检验分析结果显示，高表达circMAN1A2与男性ESCC患者、晚期原发肿瘤（T3-T4期）、淋巴结转移（N1-N3期）和病理分级2-3级呈正相关，具有统计学差异(Plt;0.05)。<br>　　3.单因素分析结果显示，男性ESCC患者、高表达circMAN1A2、晚期原发肿瘤（T3-T4期）、淋巴结转移（N1-N3期）、病理分级2-3级及临床分期Ⅲ期均对OS有显著影响(Plt;0.05)，Cox比例风险回归模型分析显示，男性ESCC患者、高表达circMAN1A2和晚期原发肿瘤（T3-T4期）是ESCC患者出现较短OS的独立危险因素(Plt;0.05)。<br>　　小结：<br>　　1.circMAN1A2高表达与ESCC患者男性性别、晚期原发肿瘤（T3-T4期）和淋巴结转移（N1-N3期）呈正相关。<br>　　2.circMAN1A2高表达是ESCC患者出现较差OS的独立危险因素。<br>　　第二部分CircMAN1A2对食管鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响研究<br>　　目的：<br>　　探讨circMAN1A2对食管鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响。<br>　　方法：<br>　　1.应用Sanger测序技术验证circMAN1A2的环化剪接位点。<br>　　2.qRT-PCR法检测circMAN1A2在四株ESCC细胞中的表达水平。<br>　　3.琼脂糖凝胶电泳评估circMAN1A2的完整性、放线菌素D实验检测circMAN1A2的稳定性、核质分离实验分析circMAN1A2的亚细胞定位。<br>　　4.qRT-PCR法检测转染circMAN1A2特异性siRNA或过表达质粒后circMAN1A2在ESCC细胞中的表达水平。<br>　　5.CCK-8法、平板克隆形成实验、划痕实验以及Transwell迁移侵袭实验检测敲低或过表达circMAN1A2后对体外ESCC细胞生物学功能的影响；裸鼠异种移植瘤模型的建立用于检测敲低circMAN1A2表达后对体内ESCC肿瘤生长的影响。<br>　　结果：<br>　　1.circMAN1A2是由1号染色体上的MAN1A2基因外显子2-5反向剪接产生，主要定位于细胞质；相对于MAN1A2mRNA，circMAN1A2在ESCC细胞中稳定表达。<br>　　2.qRT-PCR法分析结果显示，在四株ESCC细胞中，KYSE150和KYSE30细胞具有相对较高的circMAN1A2表达水平，而circMAN1A2在KYSE170和TE1细胞中的表达水平相对较低。<br>　　3.qRT-PCR法分析结果显示，转染circMAN1A2siRNA后，KYSE150和KYSE30中circMAN1A2的表达水平显著降低(Plt;0.01)，转染circMAN1A2过表达质粒后，circMAN1A2在KYSE170和TE1细胞中的表达水平显著增高(Plt;0.01)。<br>　　4.敲低circMAN1A2表达后，可抑制KYSE150和KYSE30细胞的增殖、侵袭和迁移能力(Plt;0.01)；相反，过表达circMAN1A2后显著促进了抑制KYSE170和TE1细胞的增殖、侵袭和迁移能力(Plt;0.01)。<br>　　5.裸鼠异种移植瘤实验显示，敲低circMAN1A2表达后可抑制体内ESCC肿瘤的生长(Plt;0.01)。<br>　　小结：<br>　　1.在circMAN1A2相对高表达的KYSE150和KYSE30细胞中敲低circMAN1A2表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力；在circMAN1A2相对低表达的KYSE170和TE1细胞中上调circMAN1A2能促进细胞的增殖、迁移和侵袭能力。<br>　　2.敲低circMAN1A2表达可抑制裸鼠ESCC细胞异种移植瘤的生长。<br>　　第三部分CircMAN1A2通过PKM2/NF-κB/CCL5轴促进食管鳞状细胞癌进展的机制研究<br>　　目的：<br>　　探讨circMAN1A2促进食管鳞状细胞癌进展的作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.AgilentGeneExpressionMicroarray芯片实验及数据分析用于检测circMAN1A2的下游靶mRNA。<br>　　2.qRT-PCR实验检测差异表达mRNAs在ESCC细胞中的稳定性。<br>　　3.酶联免疫吸附实验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测敲低circMAN1A2并过表达CCL5后，KYSE150和KYSE30细胞中CCL5蛋白的表达水平。<br>　　4.采用CCK-8实验、划痕愈合实验、克隆形成实验以及Transwell小室迁移或侵袭实验检测敲低circMAN1A2并过表达CCL5后，对KYSE150和KYSE30细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　5.RNApull-down实验联合Westernblot实验探索circMAN1A2调节CCL5分子分泌的机制。<br>　　结果：<br>　　1.通过AgilentGeneExpressionMicroarray芯片实验、qRT-PCR法及ELISA法分析结果显示，CCL5是KYSE150和KYSE30细胞中circMAN1A2的下游靶mRNA。<br>　　2.CCK-8及克隆形成实验结果表明，同时转染si-circMAN1A2和CCL5后可挽救由si-circMAN1A2导致的对KYSE150和KYSE30细胞增殖能力的抑制作用（P＜0.01）；划痕愈合实验及Transwell小室迁移和侵袭实验也显示相同的结果，同时转染si-circMAN1A2和CCL5后可挽救由si-circMAN1A2导致的对KYSE150和KYSE30细胞迁移和侵袭能力的减弱作用。<br>　　3.RNApull-down实验和Westernblot实验结果显示，PKM2为circMAN1A2的RNA结合蛋白(RNAbindingprotein,RBP)，敲低PKM2表达后p-p65/NF-κB和CCL5的表达明显受抑，而过表达cicMAN1A2和CCL5后这种变化可被逆转，表明circMAN1A2可通过结合PKM2调节p-p65/NF-κB诱导的CCL5分泌，促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。<br>　　小结：<br>　　1.CCL5为ESCC细胞中circMAN1A2的下游靶mRNA。<br>　　2.circMAN1A2通过PKM2/NF-κB/CCL5轴促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。<br>　　结论：<br>　　1.circMAN1A2的高表达是ESCC患者出现较差OS的独立危险因素。<br>　　2.高表达circMAN1A2可促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。<br>　　3.circMAN1A2通过结合PKM2调节p-p65/NF-κB诱导的CCL5分泌，促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。