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摘要第一部分食管鳞状细胞癌患者血清HMGB1和IDO表达水平及其临床辅助诊断的价值分析<br>　　目的：检测食管鳞状细胞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）患者血清中高迁移率族蛋白B1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）和吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）的表达水平，对比分析血清HMGB1、IDO、癌胚抗原（carcino-embryonicantigen，CEA）和鳞状细胞癌抗原（squamouscellcarcinomaantigen，SCC-Ag）与ESCC患者临床病理特征和肿瘤进展的相关性。<br>　　方法：<br>　　1．选取2021年3月至2022年8月在河北医科大学第四医院初次住院治疗的95例食管鳞状细胞癌患者为ESCC组；选取临床诊断为反流性食管炎或食管溃疡等其他良性病变患者21例为良性病变组；另选取40例健康体检者为对照组。ELISA法检测对照组、良性病变组和ESCC组血清HMGB1和IDO的表达水平。电化学发光法检测ESCC组血清CEA和SCC-Ag的含量。<br>　　2．应用Kruskal-WallisH检验比较对照组、良性病变组和ESCC组血清HMGB1和IDO表达水平的差异。<br>　　3．应用Kruskal-WallisH检验比较不同临床分期的ESCC组患者的血清HMGB1和IDO表达水平的差异。<br>　　4．应用Spearman相关性分析ESCC组患者血清HMGB1和IDO表达水平的相关性。<br>　　5．绘制ROC曲线，分析血清HMGB1和IDO表达水平对ESCC患者和食管良性病变患者辅助鉴别诊断效能。<br>　　6．将ESCC组患者分为早期组（I、II期）和晚期组（III、IV期），应用多因素Logistic回归分析血清HMGB1和IDO表达水平与ESCC患者临床进展的相关性。<br>　　7．绘制ROC曲线，分析血清HMGB1、IDO、CEA和SCC-Ag表达水平对ESCC患者临床进展的预测价值。<br>　　8．应用χ2检验分析不同水平血清HMGB1和IDO与ESCC患者临床病理特征的相关性。<br>　　结果：<br>　　1．ESCC组血清HMGB1和IDO的中位值水平明显高于对照组和良性病变组，差异有统计学意义（Plt;0.001）。<br>　　2．ESCC组临床分期为III、IV期的患者血清HMGB1和IDO中位值水平明显高于I、II期，差异有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　3．ESCC组患者血清HMGB1和IDO水平呈显著的正相关（Plt;0.05）。<br>　　4．血清HMGB1和IDO表达水平对ESCC患者和食管良性病变患者具有辅助鉴别诊断能力，其中，二者联合检测辅助鉴别诊断效能最高（Plt;0.05）。<br>　　5．ESCC患者血清HMGB1和IDO表达水平与其临床进展密切相关，二者表达水平升高是影响ESCC患者临床进展的独立危险因素（Plt;0.05）。<br>　　6．血清HMGB1、IDO、CEA和SCC-Ag的表达水平均对ESCC患者的临床进展具有预测价值，HMGB1和IDO单独或联合检测均比CEA和SCC-Ag单独或联合检测预测价值更高，HMGB1、IDO和SCC-Ag联合检测的ROC曲线下面积最大（AUC=0.903），预测的准确性最好，预测ESCC患者临床进展程度的敏感度为86.2%，特异度为86.5%，（Plt;0.05）。<br>　　7．血清HMGB1和IDO与ESCC患者T分期、N分期和临床分期有明显相关性（Plt;0.05）。<br>　　小结：ESCC患者血清HMGB1和IDO水平异常高表达，二者血清表达水平增高是ESCC临床进展的独立危险因素，对于提示ESCC病程进展具有重要作用。血清HMGB1和IDO对食管良性病变和ESCC辅助鉴别诊断具有重要价值。二者和肿瘤标记物联合检测对ESCC临床进展可能具有更高的预测价值。<br>　　第二部分食管鳞状细胞癌患者血清HMGB1、IDO表达水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性分析<br>　　目的：分析食管鳞状细胞癌患者血清HMGB1、IDO表达水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性，并探讨血清HMGB1和IDO影响机体免疫功能的相关机制。<br>　　方法：<br>　　1．纳入第一部分研究的对照组和ESCC组为研究对象。流式细胞术检测对照组和ESCC组外周血淋巴细胞亚群的百分比和绝对值计数。<br>　　2．应用Mann-WhitneyU检验比较对照组和ESCC组外周血淋巴细胞亚群水平的差异。<br>　　3．应用Kruskal-WallisH检验比较不同临床分期的ESCC组患者的外周血淋巴细胞亚群水平的差异。<br>　　4．应用Spearman相关性分析ESCC组患者血清HMGB1、IDO表达水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性。<br>　　结果：<br>　　1．ESCC组外周血CD3+T细胞绝对值计数、CD4+T细胞绝对值计数、CD8+T细胞绝对值计数、B细胞百分比和绝对值计数、NK细胞绝对值计数中位值水平明显低于对照组，差异有统计学意义（Plt;0.05），而Treg细胞百分比中位值水平明显高于对照组，差异有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　2．III、IV期患者的CD3+T细胞和CD4+T细胞绝对值计数中位值水平明显低于I期和II期（Plt;0.05）；IV期患者的B细胞绝对值计数中位值水平明显低于I、II期（Plt;0.05）；III、IV期患者的Treg细胞百分比中位值水平明显高于I期和II期（Plt;0.05），差异有统计学意义。<br>　　3．ESCC组患者血清HMGB1与外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞绝对值计数呈显著负相关，而与Treg细胞百分比呈显著正相关（Plt;0.05）；血清IDO与外周血CD3+T细胞百分比和绝对值计数、CD4+T细胞百分比和绝对值计数、CD8+T细胞和B细胞绝对值计数呈显著负相关，而与Treg细胞百分比呈显著正相关（Plt;0.05）。<br>　　小结：ESCC患者免疫功能较正常人群低，并且随着肿瘤进展，免疫功能逐渐下降。同时，血清HMGB1和IDO与ESCC患者免疫功能呈一定的相关性，二者可能通过诱导Treg细胞增殖，进而抑制免疫细胞的增殖和活化，使机体免疫功能下降，诱导肿瘤细胞免疫逃逸，促进ESCC临床进展。HMGB1和IDO可能具有成为ESCC免疫治疗新靶点的潜力。<br>　　第三部分食管鳞状细胞癌细胞中HMGB1通过NF-κB信号通路促进IDO表达作用的研究<br>　　目的：探究食管鳞状细胞癌细胞中HMGB1通过NF-κB信号通路促进IDO表达的相关机制，进而探讨血清中HMGB1促进IDO表达的调控机制。<br>　　方法：<br>　　1．应用WesternBlot法检测食管鳞状细胞癌KYSE30、ECA109细胞与人食管正常上皮细胞（humanesophagealepithelialcells，HEEC）中HMGB1和IDO的表达水平。<br>　　2．应用ELISA法检测KYSE30细胞、ECA109细胞和HEEC细胞培养上清中HMGB1和IDO的水平。<br>　　3．利用Lipo2000转染构建敲低HMGB1基因表达的KYSE30、ECA109细胞株模型，并设置成四组：空白对照组、阴性对照组（si-NC组）、敲低HMGB1基因表达组（si-HMGB1组）和先敲低HMGB1基因表达再加入佛波酯组（si-HMGB1+PMA组）。<br>　　4．通过阅读相关文献，筛选出HMGB1可能通过激活NF-κB信号通路促进IDO的表达。应用WesternBlot法检测KYSE30和ECA109细胞在敲低HMGB1基因表达后HMGB1、IDO和p65的表达水平。<br>　　5．应用WesternBlot法检测KYSE30、ECA109细胞先敲低HMGB1基因表达再加入NF-κB信号通路靶点RelA（p65）的激活剂佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）后，HMGB1、IDO和p65的表达水平。<br>　　6．应用ELISA法检测空白对照组、si-NC组、si-HMGB1组和si-HMGB1+PMA组KYSE30和ECA109细胞的培养上清中HMGB1和IDO的表达水平。<br>　　结果：<br>　　1．与HEEC细胞相比，KYSE30细胞和ECA109细胞中HMGB1和IDO表达水平显著升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　2．与HEEC细胞培养上清相比，KYSE30细胞和ECA109细胞培养上清HMGB1和IDO含量明显升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）。<br>　　3．在KYSE30细胞和ECA109细胞中，与空白对照组和si-NC组相比，si-HMGB1组中HMGB1、IDO和p65水平明显降低，差异有统计学意义（Plt;0.05）；空白对照组和si-NC组HMGB1、IDO和p65水平无明显变化，差异无统计学意义（Pgt;0.05）。<br>　　4．在KYSE30和ECA109细胞中，与si-HMGB1组相比，si-HMGB1+PMA组的IDO和p65表达水平明显增高，差异有统计学意义（Plt;0.05），si-HMGB1组和si-HMGB1+PMA组的HMGB1表达水平无明显差异（Pgt;0.05）。<br>　　5．在KYSE30和ECA109细胞培养上清中，与空白对照组和si-NC组相比，si-HMGB1组HMGB1含量明显降低，差有统计学意义（Plt;0.05）；si-HMGB1+PMA组和si-HMGB1组HMGB1含量无明显差异（Pgt;0.05）；与空白对照组和si-NC组相比，si-HMGB1组IDO含量明显降低，差异有统计学意义（Plt;0.05、Plt;0.001）；si-HMGB1+PMA组IDO含量明显高于si-HMGB1组，差异有统计学意义（Plt;0.05、Plt;0.001）。<br>　　小结：食管鳞状细胞癌KYSE30和ECA109细胞在敲低HMGB1基因表达后，IDO含量也随之下降，在加入PMA后，IDO的表达水平上升；各组细胞培养上清中HMGB1和IDO含量与细胞内各蛋白所表达水平一致，故血清中的HMGB1和IDO可能是由HMGB1通过NF-κB信号通路调控IDO的表达水平，进而分泌至细胞外产生的。为应用HMGB1和IDO抑制剂联合治疗ESCC提供新的思路。<br>　　结论：本研究第一部分发现，ESCC患者血清HMGB1和IDO水平异常高表达，二者血清表达水平增高是ESCC临床进展的独立危险因素，对于提示ESCC病程进展具有重要作用。血清HMGB1和IDO对食管良性病变和ESCC辅助鉴别诊断具有重要价值。二者和肿瘤标记物联合检测对ESCC临床进展可能具有更高的预测价值。<br>　　本研究第二部分结果显示，血清HMGB1和IDO与促进肿瘤进展和机体免疫功能下降密切相关，两种蛋白可能通过诱导Treg细胞增殖，进而抑制免疫细胞的增殖和活化，促进肿瘤的免疫逃逸。<br>　　本研究第三部分验证了在ESCC细胞中HMGB1通过NF-κB信号通路促进IDO的表达，细胞培养上清中HMGB1和IDO表达水平与胞内表达一致，故推测血清中的HMGB1和IDO可能是由HMGB1通过NF-κB信号通路调控IDO的表达水平，进而分泌至细胞外产生的。<br>　　综上所述，血清HMGB1和IDO与ESCC临床进程密切相关，提示二者可能具有成为ESCC肿瘤标记物的潜力，在ESCC辅助诊断和预测病程进展中具有重要临床价值。除此之外，血清HMGB1和IDO还与ESCC患者免疫功能密切相关，可能具有成为ESCC免疫治疗新靶点的潜力。根据该两种蛋白间的相互调控关系，应用HMGB1和IDO抑制剂进行联合治疗可能会取得更好的疗效，为ESCC双靶点联合治疗提供新的思路。