摘要第一部分食管鳞状细胞癌患者血清HMGB1和IDO表达水平及其临床辅助诊断的价值分析<br> 目的:检测食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)患者血清中高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)和吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)的表达水平,对比分析血清HMGB1、IDO、癌胚抗原(carcino-embryonicantigen,CEA)和鳞状细胞癌抗原(squamouscellcarcinomaantigen,SCC-Ag)与ESCC患者临床病理特征和肿瘤进展的相关性。<br> 方法:<br> 1.选取2021年3月至2022年8月在河北医科大学第四医院初次住院治疗的95例食管鳞状细胞癌患者为ESCC组;选取临床诊断为反流性食管炎或食管溃疡等其他良性病变患者21例为良性病变组;另选取40例健康体检者为对照组。ELISA法检测对照组、良性病变组和ESCC组血清HMGB1和IDO的表达水平。电化学发光法检测ESCC组血清CEA和SCC-Ag的含量。<br> 2.应用Kruskal-WallisH检验比较对照组、良性病变组和ESCC组血清HMGB1和IDO表达水平的差异。<br> 3.应用Kruskal-WallisH检验比较不同临床分期的ESCC组患者的血清HMGB1和IDO表达水平的差异。<br> 4.应用Spearman相关性分析ESCC组患者血清HMGB1和IDO表达水平的相关性。<br> 5.绘制ROC曲线,分析血清HMGB1和IDO表达水平对ESCC患者和食管良性病变患者辅助鉴别诊断效能。<br> 6.将ESCC组患者分为早期组(I、II期)和晚期组(III、IV期),应用多因素Logistic回归分析血清HMGB1和IDO表达水平与ESCC患者临床进展的相关性。<br> 7.绘制ROC曲线,分析血清HMGB1、IDO、CEA和SCC-Ag表达水平对ESCC患者临床进展的预测价值。<br> 8.应用χ2检验分析不同水平血清HMGB1和IDO与ESCC患者临床病理特征的相关性。<br> 结果:<br> 1.ESCC组血清HMGB1和IDO的中位值水平明显高于对照组和良性病变组,差异有统计学意义(Plt;0.001)。<br> 2.ESCC组临床分期为III、IV期的患者血清HMGB1和IDO中位值水平明显高于I、II期,差异有统计学意义(Plt;0.05)。<br> 3.ESCC组患者血清HMGB1和IDO水平呈显著的正相关(Plt;0.05)。<br> 4.血清HMGB1和IDO表达水平对ESCC患者和食管良性病变患者具有辅助鉴别诊断能力,其中,二者联合检测辅助鉴别诊断效能最高(Plt;0.05)。<br> 5.ESCC患者血清HMGB1和IDO表达水平与其临床进展密切相关,二者表达水平升高是影响ESCC患者临床进展的独立危险因素(Plt;0.05)。<br> 6.血清HMGB1、IDO、CEA和SCC-Ag的表达水平均对ESCC患者的临床进展具有预测价值,HMGB1和IDO单独或联合检测均比CEA和SCC-Ag单独或联合检测预测价值更高,HMGB1、IDO和SCC-Ag联合检测的ROC曲线下面积最大(AUC=0.903),预测的准确性最好,预测ESCC患者临床进展程度的敏感度为86.2%,特异度为86.5%,(Plt;0.05)。<br> 7.血清HMGB1和IDO与ESCC患者T分期、N分期和临床分期有明显相关性(Plt;0.05)。<br> 小结:ESCC患者血清HMGB1和IDO水平异常高表达,二者血清表达水平增高是ESCC临床进展的独立危险因素,对于提示ESCC病程进展具有重要作用。血清HMGB1和IDO对食管良性病变和ESCC辅助鉴别诊断具有重要价值。二者和肿瘤标记物联合检测对ESCC临床进展可能具有更高的预测价值。<br> 第二部分食管鳞状细胞癌患者血清HMGB1、IDO表达水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性分析<br> 目的:分析食管鳞状细胞癌患者血清HMGB1、IDO表达水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性,并探讨血清HMGB1和IDO影响机体免疫功能的相关机制。<br> 方法:<br> 1.纳入第一部分研究的对照组和ESCC组为研究对象。流式细胞术检测对照组和ESCC组外周血淋巴细胞亚群的百分比和绝对值计数。<br> 2.应用Mann-WhitneyU检验比较对照组和ESCC组外周血淋巴细胞亚群水平的差异。<br> 3.应用Kruskal-WallisH检验比较不同临床分期的ESCC组患者的外周血淋巴细胞亚群水平的差异。<br> 4.应用Spearman相关性分析ESCC组患者血清HMGB1、IDO表达水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性。<br> 结果:<br> 1.ESCC组外周血CD3+T细胞绝对值计数、CD4+T细胞绝对值计数、CD8+T细胞绝对值计数、B细胞百分比和绝对值计数、NK细胞绝对值计数中位值水平明显低于对照组,差异有统计学意义(Plt;0.05),而Treg细胞百分比中位值水平明显高于对照组,差异有统计学意义(Plt;0.05)。<br> 2.III、IV期患者的CD3+T细胞和CD4+T细胞绝对值计数中位值水平明显低于I期和II期(Plt;0.05);IV期患者的B细胞绝对值计数中位值水平明显低于I、II期(Plt;0.05);III、IV期患者的Treg细胞百分比中位值水平明显高于I期和II期(Plt;0.05),差异有统计学意义。<br> 3.ESCC组患者血清HMGB1与外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞绝对值计数呈显著负相关,而与Treg细胞百分比呈显著正相关(Plt;0.05);血清IDO与外周血CD3+T细胞百分比和绝对值计数、CD4+T细胞百分比和绝对值计数、CD8+T细胞和B细胞绝对值计数呈显著负相关,而与Treg细胞百分比呈显著正相关(Plt;0.05)。<br> 小结:ESCC患者免疫功能较正常人群低,并且随着肿瘤进展,免疫功能逐渐下降。同时,血清HMGB1和IDO与ESCC患者免疫功能呈一定的相关性,二者可能通过诱导Treg细胞增殖,进而抑制免疫细胞的增殖和活化,使机体免疫功能下降,诱导肿瘤细胞免疫逃逸,促进ESCC临床进展。HMGB1和IDO可能具有成为ESCC免疫治疗新靶点的潜力。<br> 第三部分食管鳞状细胞癌细胞中HMGB1通过NF-κB信号通路促进IDO表达作用的研究<br> 目的:探究食管鳞状细胞癌细胞中HMGB1通过NF-κB信号通路促进IDO表达的相关机制,进而探讨血清中HMGB1促进IDO表达的调控机制。<br> 方法:<br> 1.应用WesternBlot法检测食管鳞状细胞癌KYSE30、ECA109细胞与人食管正常上皮细胞(humanesophagealepithelialcells,HEEC)中HMGB1和IDO的表达水平。<br> 2.应用ELISA法检测KYSE30细胞、ECA109细胞和HEEC细胞培养上清中HMGB1和IDO的水平。<br> 3.利用Lipo2000转染构建敲低HMGB1基因表达的KYSE30、ECA109细胞株模型,并设置成四组:空白对照组、阴性对照组(si-NC组)、敲低HMGB1基因表达组(si-HMGB1组)和先敲低HMGB1基因表达再加入佛波酯组(si-HMGB1+PMA组)。<br> 4.通过阅读相关文献,筛选出HMGB1可能通过激活NF-κB信号通路促进IDO的表达。应用WesternBlot法检测KYSE30和ECA109细胞在敲低HMGB1基因表达后HMGB1、IDO和p65的表达水平。<br> 5.应用WesternBlot法检测KYSE30、ECA109细胞先敲低HMGB1基因表达再加入NF-κB信号通路靶点RelA(p65)的激活剂佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)后,HMGB1、IDO和p65的表达水平。<br> 6.应用ELISA法检测空白对照组、si-NC组、si-HMGB1组和si-HMGB1+PMA组KYSE30和ECA109细胞的培养上清中HMGB1和IDO的表达水平。<br> 结果:<br> 1.与HEEC细胞相比,KYSE30细胞和ECA109细胞中HMGB1和IDO表达水平显著升高,差异有统计学意义(Plt;0.05)。<br> 2.与HEEC细胞培养上清相比,KYSE30细胞和ECA109细胞培养上清HMGB1和IDO含量明显升高,差异有统计学意义(Plt;0.05)。<br> 3.在KYSE30细胞和ECA109细胞中,与空白对照组和si-NC组相比,si-HMGB1组中HMGB1、IDO和p65水平明显降低,差异有统计学意义(Plt;0.05);空白对照组和si-NC组HMGB1、IDO和p65水平无明显变化,差异无统计学意义(Pgt;0.05)。<br> 4.在KYSE30和ECA109细胞中,与si-HMGB1组相比,si-HMGB1+PMA组的IDO和p65表达水平明显增高,差异有统计学意义(Plt;0.05),si-HMGB1组和si-HMGB1+PMA组的HMGB1表达水平无明显差异(Pgt;0.05)。<br> 5.在KYSE30和ECA109细胞培养上清中,与空白对照组和si-NC组相比,si-HMGB1组HMGB1含量明显降低,差有统计学意义(Plt;0.05);si-HMGB1+PMA组和si-HMGB1组HMGB1含量无明显差异(Pgt;0.05);与空白对照组和si-NC组相比,si-HMGB1组IDO含量明显降低,差异有统计学意义(Plt;0.05、Plt;0.001);si-HMGB1+PMA组IDO含量明显高于si-HMGB1组,差异有统计学意义(Plt;0.05、Plt;0.001)。<br> 小结:食管鳞状细胞癌KYSE30和ECA109细胞在敲低HMGB1基因表达后,IDO含量也随之下降,在加入PMA后,IDO的表达水平上升;各组细胞培养上清中HMGB1和IDO含量与细胞内各蛋白所表达水平一致,故血清中的HMGB1和IDO可能是由HMGB1通过NF-κB信号通路调控IDO的表达水平,进而分泌至细胞外产生的。为应用HMGB1和IDO抑制剂联合治疗ESCC提供新的思路。<br> 结论:本研究第一部分发现,ESCC患者血清HMGB1和IDO水平异常高表达,二者血清表达水平增高是ESCC临床进展的独立危险因素,对于提示ESCC病程进展具有重要作用。血清HMGB1和IDO对食管良性病变和ESCC辅助鉴别诊断具有重要价值。二者和肿瘤标记物联合检测对ESCC临床进展可能具有更高的预测价值。<br> 本研究第二部分结果显示,血清HMGB1和IDO与促进肿瘤进展和机体免疫功能下降密切相关,两种蛋白可能通过诱导Treg细胞增殖,进而抑制免疫细胞的增殖和活化,促进肿瘤的免疫逃逸。<br> 本研究第三部分验证了在ESCC细胞中HMGB1通过NF-κB信号通路促进IDO的表达,细胞培养上清中HMGB1和IDO表达水平与胞内表达一致,故推测血清中的HMGB1和IDO可能是由HMGB1通过NF-κB信号通路调控IDO的表达水平,进而分泌至细胞外产生的。<br> 综上所述,血清HMGB1和IDO与ESCC临床进程密切相关,提示二者可能具有成为ESCC肿瘤标记物的潜力,在ESCC辅助诊断和预测病程进展中具有重要临床价值。除此之外,血清HMGB1和IDO还与ESCC患者免疫功能密切相关,可能具有成为ESCC免疫治疗新靶点的潜力。根据该两种蛋白间的相互调控关系,应用HMGB1和IDO抑制剂进行联合治疗可能会取得更好的疗效,为ESCC双靶点联合治疗提供新的思路。
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