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摘要目的：高迁移率族蛋白B1（HighMobilityGroupBox1，HMGB1）在牙周炎的发生发展中扮演着关键角色，尤其是在伴有吸烟的牙周炎患者中。然而，HMGB1吸烟引起牙周炎加重中的病理机制尚不明确，本研究通过培养骨髓来源巨噬细胞（Bonemarrowmacrophages，BMMs），给予巨噬细胞香烟烟雾提取物(Cigarettesmokeextract,CSE)和牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LipopolysaccharidefromPorphyromonasgingivalis，Pg-LPS）等刺激，探究伴吸烟牙周炎中HMGB1在巨噬细胞内的表达情况，以及伴吸烟牙周炎中HMGB1对巨噬细胞极化的影响及其可能的相关机制。<br>　　方法：<br>　　1.BMMs原代培养：完整取下6-8周龄C57BL/6小鼠的股骨和胫骨进行原代细胞的培养，流式细胞术检测细胞表面阳性表达标记物CD11b，以进行后续的研究。<br>　　2.CSE刺激HMGB1蛋白在巨噬细胞中的移位与释放：本部分实验分CON组、CSE组、Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS组。分别给予完全培养基、1%CSE、250ng/mLPg-LPS以及1%CSE+250ng/mLPg-LPS，刺激BMMs24h，通过免疫荧光染色技术测定细胞内HMGB1的含量与分布情况；收集各组细胞上清液，应用ELISA检测法测定胞外HMGB1蛋白含量。<br>　　3.CSE对HMGB1刺激巨噬细胞极化的影响：本部分实验分CON组、Pg-LPS组、IL-4组、CSE组、CSE+rHMGB1组、CSE+anti-HMGB1组、CSE+Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS+rHMGB1组、CSE+Pg-LPS+anti-HMGB1组。分别给予完全培养基、250ng/mLPg-LPS，20ng/mLIL-4，1%CSE，1%CSE+1μg/mLrHMGB1，1%CSE+1μg/mLanti-HMGB1，1%CSE+250ng/mLPg-LPS，1%CSE+250ng/mLPg-LPS+1μg/mLrHMGB1，1%CSE+250ng/mLPg-LPS+1μg/mLanti-HMGB1刺激BMMs6h后，使用qPCR法检测巨噬细胞M1标志物：iNOS、TNF-α、IL-6及M2标志物：ARG-1、RELM-α、MRC-1的mRNA表达情况。<br>　　4.CSE刺激巨噬细胞膜表达HMGB1特异性受体：本部分实验分CON组、Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS组。分别采用完全培养基、250ng/mLPg-LPS、1%CSE+250ng/mLPg-LPS刺激BMMs24h后，使用流式细胞术检测BMMs表面受体晚期糖基化终末产物受体(ReceptorofAdvancedGlycationEndproducts,RAGE)、Toll样受体4(TollLikeReceptor4,TLR4)表达情况，并分析各组细胞RAGE、TLR4蛋白表达情况。<br>　　结果：<br>　　1.BMMs原代培养及鉴定：经细胞提取、培养后，应用流式细胞术检测其表面阳性表达标记物CD11b确定所提取细胞确实为巨噬细胞。<br>　　2.CSE刺激HMGB1蛋白在巨噬细胞中的移位与释放：<br>　　2.1免疫荧光染色显示：CON组中HMGB1位于细胞核内，而CSE组，Pg-LPS组和CSE+Pg-LPS组在经过24h刺激后，HMGB1表达量显著提高（Plt;0.05），且其从细胞核转移到细胞质中。<br>　　2.2ELISA检测法结果显示：与CON组相比，CSE组和Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS组HMGB1水平均显著升高(Plt;0.01)；与Pg-LPS组相比，CSE+Pg-LPS组HMGB1水平明显升高(Plt;0.05)。<br>　　3.CSE对HMGB1刺激巨噬细胞极化的影响<br>　　PCR结果显示：M1标记物：与CON组相比，Pg-LPS组的IL-6基因表达量显著升高(Plt;0.01)，CSE组、CSE+rHMGB1组、CSE+Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS+rHMGB1组、CSE+Pg-LPS+anti-HMGB1组的IL-6基因表达量明显升高(Plt;0.05)，IL-4组、CSE+anti-HMGB1组无明显统计学意义。与CON组相比，CSE+Pg-LPS+rHMGB1组的iNOS基因表达量显著升高(Plt;0.01)，Pg-LPS组、CSE组、CSE+rHMGB1组、CSE+Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS+anti-HMGB1组的iNOS基因表达量明显升高(Plt;0.05)，IL-4组和CSE+anti-HMGB1组无明显统计学意义。与CON组相比，Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS+rHMGB1组的TNF-α基因表达量显著升高(Plt;0.01)，CSE组、CSE+rHMGB1组、CSE+Pg-LPS+anti-HMGB1组的TNF-α基因表达量明显升高(Plt;0.05)，IL-4组和CSE+anti-HMGB1组无明显统计学意义；M2标记物：与CON组相比，IL-4组的ARG-1、MRC-1、RELM-α基因表达量显著升高(Plt;0.01)，Pg-LPS组、CSE组、CSE+rHMGB1组、CSE+Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS+anti-HMGB1组、CSE+anti-HMGB1组和CSE+Pg-LPS+rHMGB1组均无明显统计学意义。<br>　　4.CSE刺激巨噬细胞膜表达HMGB1特异性受体<br>　　流式细胞术结果显示：与CON组相比，Pg-LPS组、CSE+Pg-LPS组TLR4表达显著增加(Plt;0.01)，与Pg-LPS组相比CSE+Pg-LPS组TLR4表达明显增加(Plt;0.05)，RAGE表达无明显统计学意义。<br>　　结论：<br>　　1.原代培养小鼠骨髓巨噬细胞表达标志物CD11b，所用细胞为巨噬细胞。<br>　　2.CSE和Pg-LPS同时刺激会引起巨噬细胞分泌HMGB1明显增加。<br>　　3.CSE和Pg-LPS可能促使巨噬细胞M1型极化进而促进吸烟加重慢性牙周炎的发展。<br>　　4.CSE可能通过激活TLR4信号通路促进HMGB1诱导巨噬细胞向M1方向的极化。