TNF-α对肥胖型PCOS患者颗粒细胞糖摄取的影响及机制研究-论文-万方医学网

首页 > 河北医科大学 > TNF-α对肥胖型PCOS患者颗粒细胞糖摄取的影响及机制研究

TNF-α对肥胖型PCOS患者颗粒细胞糖摄取的影响及机制研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要卵泡是卵巢的基本组成单位，卵泡膜细胞包绕在卵泡的最外层，内层衬以壁层颗粒细胞以及围绕在卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞组成。卵泡发育历经四个阶段分别是原始卵泡的启动及募集、窦前卵泡发育、优势卵泡选择、排卵和排卵后黄体生成，这是一个动态的连续过程伴随着卵泡直径的增大和颗粒细胞增殖同时功能分化。颗粒细胞扩增和分泌的激素可以促进卵母细胞的发育和成熟。颗粒细胞糖代谢的异常是造成女性卵泡发育异常、卵母细胞质量下降的重要原因。伴随卵泡的生长，窦状卵泡与颗粒细胞间积聚的卵泡液逐渐增加并且融合形成卵泡腔，这些是构成卵母细胞生长的微环境。卵泡液中含有多种细胞因子参与调节颗粒细胞的糖摄取及生殖激素分泌，且与颗粒细胞共同调节卵母细胞的生长。 　　卵泡液及壁层颗粒细胞是卵母细胞周围的重要组成部分，它对卵子的质量及卵子的发育起重要作用。卵泡液中TNF-α、IL-1、IL-6等多种细胞因子，这些细胞因子对卵子的成熟和发育潜能的获得起重要作用。其中TNF-α除主要由巨噬细胞产生外，脂肪组织也可以分泌。 　　在卵巢发育周期中，颗粒细胞的糖摄取功能降低与卵母细胞的质量下降，以及女性生育能力减弱具有密切的关系，确保颗粒细胞糖摄取功能正常对于卵母细胞成熟和发育潜能的获得至关重要。另一方面，卵母细胞不能直接进行糖摄取，其需要的能量需要从颗粒细胞获取。因此，颗粒细胞能量代谢对维持卵母细胞内环境稳定具有重要意义。 　　多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是伴随育龄期女性生育期最常见妇科代谢和内分泌疾病，以肥胖、高雄激素血症、卵巢内持续存在卵泡发育成熟障碍和低度炎症状态为特征。主要临床表现为不孕、高雄激素血症生化指标的增高及高雄激素血症的临床表现如多毛和/或痤疮及月经周期不规律。75%的PCOS病人有高雄激素血症的临床表现，且卵泡液中的睾酮也是明显升高的，尤其是合并肥胖型PCOS患者。约60%的PCOS病人表现为肥胖。肥胖也表现为一种低度炎症状态，有研究提示肥胖和PCOS患者的血清TNF-α都是增高的，近些年来由于肥胖在全球的流行和肥胖不孕患者逐年增多，有学者研究提示伴有肥胖的PCOS不孕患者的血清TNF-α浓度增高明显。 　　在体外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET)助孕过程中发现PCOS合并肥胖的不孕患者获得的成熟卵子率和形成的胚胎质量均下降，出现低受精率、低妊娠率、高流产率的现象。在高雄激素浓度伴随低度炎症状态下颗粒细胞糖摄取功能是否受到影响，在高雄激素状态下炎症因子TNF-α对颗粒细胞糖摄取的影响机制尚未见明确报导。 　　本实验通过检测PCOS不孕患者卵泡液中炎症因子的表达、颗粒细胞的糖摄取、在颗粒细胞中GLUT4mRNA的表达及在颗粒细胞膜中其蛋白质水平的表达状况，观察肥胖PCOS患者卵泡液是否有高水平炎症因子和相应颗粒细胞糖摄取降低以及与卵子质量和胚胎质量的关系。在此基础上，通过对PCOS颗粒细胞糖摄取异常可能的机制进行研究，进而为PCOS合并肥胖患者的发病机制提供一个可能的理论依据，从而为反复流产的肥胖的PCOS患者提供一个可能的治疗思路。 　　第一部分肥胖型PCOS患者卵泡液中TNF-α对卵泡壁层颗粒细胞糖摄取的影响 　　目的：通过检测体重正常及肥胖型PCOS和非PCOS的不孕患者卵泡液中睾酮和炎症因子TNF-α、IL-6的浓度及其卵泡中颗粒细胞糖摄取的情况，探讨肥胖PCOS对于体外受精胚胎移植卵子及胚胎发育的影响。 　　方法：于2021年4月-2022年3月期间，选取石家庄市第四医院生殖中心进行IVF-ET助孕的PCOS患者41例，根据体重指数分为P1组：体重正常PCOS组(18＜BMI≤24)、P2组：肥胖PCOS组(28＜BMI≤40)；同时选取单纯男方因素导致不孕患者46例，分为N1组：体重正常组(18＜BMI≤24)、N2组：肥胖组(28＜BMI≤40)。收集四组患者的基本临床资料和超促排卵(Controlledovarianstimulation,COS)及体外受精(IVF)结局进行统计学分析，用ELISA方法检测卵泡液中睾酮和炎症因子TNF-α、IL-6的浓度，收集四组患者卵泡液中颗粒细胞提取mRNA用qPCR检测其GLUT4的mRNA水平；收集四组病人颗粒细胞进行培养，用免疫荧光实验检测的其glut4蛋白质在细胞膜的表达以及颗粒细胞葡萄糖摄取情况并进行统计学分析。 　　结果： 　　1.患者一般情况及临床资料特点 　　共收集87例患者分为P1组(体重正常PCOS组)和P2组(肥胖PCOS组)，N1组(体重正常对照组)和N2组(肥胖正常对照组)，比较四组患者的一般资料，AMH值，在N1组显著低于P1组(4.53±2.17vs13.38±3.63P＜0.01)、N2组显著低于P2组(5.61±2.62vs13.96±2.82P＜0.01)；基础LH值，N1组明显低于P1组(6.17±2.08vs9.05±3.23,P＜0.05)、N2组明显低于P2组(5.46±2.57vs9.23±2.68P＜0.01)；基础T浓度，N1组显著低于P1组(1.01±0.13vs1.35±0.29,P＜0.01)、N2组显著低于P2组(1.06±0.15vs1.48±0.18P＜0.01)；LH/FSH比值，N1组明显低于P1组(1.24±0.44vs1.74±0.76,P＜0.01)、N2组明显低于P2组(1.15±0.53vs1.91±0.67P＜0.01)，BMI对应的四组患者两两比较年龄、BMI、不孕年限、基础FSH、E2、P等比较均无统计学差异(P＞0.05)。 　　收集的87例患者中以非PCOS组（N1组、N2组）及PCOS组（P1组、P2组）两两比较患者临床资料发现，BMI肥胖组高于非肥胖组；基础E2P1组大于P2组；基础睾酮水平P2组高于P1组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。四组患者两两比较年龄、不孕年限、基础FSH、E2、P等比较均无统计学差异(P＞0.05)。 　　2.COS和IVF结局 　　比较四组患者COS和IVF结局指标，结果显示N1组患者的获卵数明显低于P1患者(13.47±1.94vs16.44±2.35P＜0.05)，而N2组与P2组的获卵数比较无明显差异(P＞0.05)；成熟卵率N1组显著高于P1组(92.11±1.28vs87.31±1.61,P＜0.05)，N2组显著高于P2组(87.81±1.14vs83.37±1.64,P＜0.05)；2PN受精率N1组显著高于P1组(74.18±1.62vs69.67±2.72,P＜0.05)，N2组显著高于P2组(71.75±.98vs64.01±1.99,P＜0.05)；优胚率N1组明显高于P1组(55.10±1.01vs53.01±1.10,P＜0.05)，N2组明显高于P2组(53.67±1.39vs50.00±1.72,P＜0.05)。 　　收集的87例患者中以非PCOS组（N1组、N2组）及PCOS组（P1组、P2组）两两比较患者临床资料发现，获卵数、成熟卵数、N1组、2PN受精率及优胚率体重正常组均高于肥胖组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 　　3.卵泡液中睾酮以及炎症因子TNF-α、IL-6的浓度 　　用ELISA方法测定四组患者的卵泡液中T、TNF-α、IL-6的浓度，并进行体重匹配的患者两两比较发现，N1组T水平明显低于P1组(1.34±0.12vs3.54±0.37,P＜0.05)、N2组明显低于P2组(1.93±0.59vs4.05±0.41,P＜0.05)以及N2组明显高于N1组(1.34±0.12vs1.93±0.59,P＜0.05）、P2组明显高于P1组(3.54±0.37vs4.05±0.41,P＜0.05)；TNF-α浓度N1组显著低于P1组(42.3±10.34vs50.43±7.38,P＜0.05)，N2组显著低于P2组(46.91±8.71vs59.89±7.67,P＜0.05)和和P1明显低于P1组（50.43±7.38vs59.89±7.67,P＜0.05）；IL-6水平N1组显著低于P1组(19.67±6.73vs29.51±5.27,P＜0.05)，N2组显著低于vP2组(23.61±5.12vs33.35±3.72,P＜0.05)。 　　4．颗粒细胞GLUT4的mRNA水平及蛋白质的表达 　　颗粒细胞GLUT4mRNA的表达用qPCR的方法检测，结果进行体重匹配的患者两两比较发现，N1组明显高于P1组(1.08±0.10vs0.56±0.03,P＜0.05)、N2组明显高于P2组(0.69±0.06vs0.50±0.04,P＜0.05)；glut4蛋白质表达用免疫荧光的方法检测，cellsenses读取绿色荧光灰度值。体重匹配的患者两两比较发现，N1组高于P1组(926.52±88.09vs375.57±47.93,P＜0.05)、N2组高于P2组(456.95±82.60vs159.50±23.80,P＜0.05)；体重不同的对照组及PCOS组之间两两比较发现，GLUT4mRNA和glut4蛋白质的表达N1组均明显高于N2组，P1组均明显高于P2组，差异比较有统计学意义。 　　5．壁层颗粒细胞糖摄取的检测 　　在N1、P1、N2、P2四组病人的颗粒细胞用葡萄糖荧光替代物2-NBDG进行了葡萄糖摄取实验，细胞内Glucoseuptake情况用2-NBDG的绿色荧光强度表示，用cellsenses读取其灰度值，实验结果进行体重匹配的对照组与PCOS患者两两比较发现，N1组显著高于P1组(1172.80±96.83vs391.81±99.99,P＜0.05)，N2组显著高于P2组(714.48±58.13vs232.89±63.23,P＜0.05)；体重不同的对照组及PCOS组之间两两比较发现，颗粒细胞糖摄取N1组均明显高于N2组，P1组均明显高于P2组，差异比较均有统计学意义（P＜0.05）。 　　结论：研究显示肥胖型PCOS患者卵泡液中的睾酮及炎症因子TNF-α和IL-6的浓度明显增高，在高雄激素及低度炎症状态微环境下，壁层颗粒细胞的糖摄取能力明显降低，糖摄取能力降低导致的能量代谢异常，影响了COS和IVF的实验结局，导致成熟卵率和优质胚胎率下降。 　　第二部分肥胖型PCOS对人颗粒细胞糖摄取影响的机制研究 　　目的：探讨高雄激素浓度下TNF-α通过NF-κB信号通路对颗粒细胞糖摄取的影响。 　　方法： 　　1.将人颗粒细胞KGN细胞分为四组分别用100nmol/L的睾酮(T组)、100ng/ml的TNF-α(α组)和100nmol/L的睾酮+100ng/ml的TNF-α(T+α组)刺激人颗粒细胞株KGN细胞24小时以及饥饿24小时的KGN细胞(con组)，收集细胞后用qPCR测定GLUT4mRNA水平及westernbloting测定glut4蛋白质的表达，用免疫荧光测定其在细胞膜的表达；用免疫荧光法测定四组细胞内糖摄取的情况；用westernbloting检测NF-κB通路蛋白质TNFRⅡ、IKKβ、p-IKKβ和TP65及p-P65的表达。 　　2.以100nmol/L睾酮、100ng/mlTNF-α、二者共同刺激的KGN细胞均添加TNFRⅡ拮抗剂Qiangke共同刺激KGN细胞24小时(分别命名为T+Qiangke组，α+Qiangke组，T+α+Qiangke组)，收集细胞用westernbloting检测NF-κB通路蛋白质TNFRⅡ、IKKβ、p-IKKβ和TP65及p-P65的蛋白质表达；用免疫荧光测定T+α+Qiangke组的KGN细胞glut4蛋白质在细胞膜的表达；用倒置荧光显微镜下观察细胞内2-NDBG的绿色荧光强度并用cellsences读取细胞内绿色荧光的灰度值，所有数据进行统计学分析。 　　3.用小干扰RNA(siRNA)敲降TNFRⅠ的表达这部分实验分5组：空白对照组(blankcontrolgroup，BC组)，阴性对照组(negativecontrolgroup，NC组)，TNFRⅠ敲降组(TNFRⅠknockdowngroup，TR1组)，阳性对照组(positivecontrolgroup，PC)，TNFRⅠ敲降后用100nmol/L睾酮+100ng/mlTNF-α共同刺激KGN细胞24小时(AfterTNFRⅠknockdown,theKGNcellsco-cultureedwith100nMtestosterone+100ng/mlTNF-αfor24hours,T+α组)。收集细胞用westernblotTNFRⅠ确认蛋白质水平的表达，以及检测NF-κB通路蛋白质TNFRⅠ、TNFRⅡ、IKKβ、p-IKKβ和TP65及p-P65的表达，用倒置荧光显微镜观察2-NDBG在细胞5组细胞内绿色荧光强度、cellsences读取其绿色荧光灰度值进行统计学分析。 　　4.用NF-κB通路抑制剂IMD-0354预处理30分钟和未用IMD0354预处理的KGN细胞用100nmol/L的睾酮+100ng/ml的TNF-α共同刺激KGN细胞0、1、2、4、6、12小时后倒置荧光显微镜观察细胞内2-NDBG的绿色荧光强度、cellsences读取其绿色荧光灰度值，收集细胞用westernbloting测定p-P65蛋白质的表达。 　　结果： 　　1.糖摄取的差异T+α组细胞内糖摄取低于con、T、α组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　2.GLUT4表达的差异T+α组GLUT4总mRNA及glut4总蛋白质水平的水平低于con、T、α组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　3.Glut4蛋白在细胞膜表达的差异T+α组GLUT4蛋白质在细胞膜的表达低于con、T、α组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　4.NF-κB通路蛋白的测定T+α组的TNFRⅡ、p-IKKβ和p-P65蛋白质均高于con、T、α组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　5.添加TNFRⅡ抑制剂T+α组添加Qiangke共同刺激后细胞内糖摄取较T+α组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；Glut4蛋白质在细胞膜表达较T+α组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；NF-κB通路蛋白质TNFRⅡ、p-IKKβ和p-P65的表达均明显低于T+α组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 　　6.用小干扰RNA(siRNA)敲降TNFRⅠ的表达采用siRNA下调TNFR1的表达，糖摄取结果提示TNFRⅠ降调后T+α组KGN细胞糖摄取明显低于其他四组，比较有统计学意义(P＜0.01)，其余四组各组间糖摄取比较无明显差异。TNFRⅠ敲降后用T+α刺激后细胞内糖摄取较TNFRⅠ敲降组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；NF-κB信号通路蛋白表达结果提示TR1组细胞TNFR1低于其余四组细胞蛋白的表达(TR1vsBC、NC、PC，P＜0.05，TR1vsT+αP＜0.01)；TNFRⅠ降调后T+α组TNFR2、p-IKKβ、P-P65蛋白的表达高于其他四组，差异有统计学意义(P＜0.05)，BC组、NC组、TR1组和PC组的TNFR2、p-IKKβ、P-P65的蛋白质表达无明显差异(P＞0.05)。 　　7.IKKβ抑制剂阻断NF-κB通路用NF-κB通路抑制剂IMD-0354预处理KGN细胞30分钟用100nmol/L的睾酮+100ng/ml的TNF-α共同刺激KGN于4、6、12小时p-P65蛋白质的表达较未预处理的KGN细胞是降低的，同时IMD-0354预处理30分钟的KGN细胞的细胞内糖摄取较未用IMD-0354处理的细胞是明显升高的，两个指标的数据组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　结论： 　　1.肥胖型PCOS患者卵泡液中睾酮及炎症因子TNF-α和IL-6的浓度明显增高，壁层颗粒细胞的糖摄取能力明显降低，导致获卵数减少和优质胚胎率降低。 　　2.高雄激素状态下TNF-α可通过TNFRⅡ-IKKβ-P65激活NF-κB信号通路，使人颗粒细胞KGN细胞的GLUT4的表达明显下降，细胞糖摄取明显下降。 　　3.TNFRⅡ拮抗剂可以改善高雄激素状态下TNF-α通过NF-κB信号通路引起的炎症反应，从而改善颗粒细胞的糖摄取功能。 　　4.TNFRⅠ的降调不影响人颗粒细胞糖摄取情况。 　　5.NF-κB通路抑制剂IMD-0354可以阻断高雄激素状态下TNF-α通过NF-κβ信号通路引起的炎症反应，从而改善人颗粒细胞KGN细胞的糖摄取功能。