miR-214-3p通过调控HDAC9改善脓毒症心肌功能障碍的研究-论文-万方医学网

miR-214-3p通过调控HDAC9改善脓毒症心肌功能障碍的研究

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摘要脓毒症是指宿主对致病菌（细菌、真菌、病毒等微生物）感染反应失调所导致的多器官功能障碍，可危及患者生命。心脏是脓毒症发生时最易受损的靶器官之一，常见的临床表现为患者心肌舒缩功能障碍、心肌细胞的变性和坏死。统计数据显示，大约40%-50%的脓毒症患者会出现心肌损伤，心肌细胞的变性、坏死和舒缩功能障碍是主要表现，重者可出现心竭、休克、心律失常等。脓毒症心肌功能障碍(sepsisinducedmyocardialdysfunction，SIMD)是脓毒症相关死亡的一个主要原因，SIMD也是脓毒症的严重并发症之一，与脓毒症的高死亡率相关，其主要表现为心室舒缩功能障碍、心室扩张，从而导致患者射血分数下降和休克。研究发现，多种机制参与并调控了SIMD的发生发展，其中包括细胞凋亡、氧化应激、炎症介质、线粒体障碍、钙调节异常等。 　　miRNAs是内源性的非编码小RNA，广泛存在于血液、尿液和汗液中，通过对靶mRNA的降解来对转录后基因表达起调控作用，同时通过免疫细胞分化、凋亡、免疫抑制、炎症反应等来控制脓毒症的发生发展。研究发现，miR-214-3p表达上调在脓毒症相关的心肌损伤中可以减轻炎症反应和自由基损害，抑制细胞自噬及凋亡，改善脓毒症相关的心肌功能障碍。 　　HDAC9位于人类7号染色体，在心脏中高表达。研究发现，HDAC9可通过调节P38-MAPK的磷酸化水平介导氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的血管内皮细胞炎症损伤导致动脉粥样硬化。基于HDAC9抑制在缺血性损伤方面抑制炎症因子释放、保护细胞的作用，我们猜测HDAC9在脓毒症心肌功能障碍方面可能存在类似的作用，结合miR-214-3p在脓毒症心肌功能障碍方面的心肌保护作用，设想miR-214-3p可通过调节HDAC9的表达，改善脓毒症相关的心肌功能障碍，减轻炎症反应、保护细胞功能。经生信分析预测，miR-214-3p与HDAC9-3''UTR之间存在靶向结合位点。我们拟从体外细胞层面、体内动物模型层面以及临床样本层面观察miR-214-3p与HDAC9对脓毒症相关心肌功能障碍的影响，并探讨其潜在的分子机制。本研究共三个部分。 　　第一部分miR-214-3p和HDAC9在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中的研究 　　目的： 　　1.检测miR-214-3p和HDAC9在LPS诱导的H9C2心肌细胞中的表达。 　　2.敲低HDAC9，观察其对LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响。 　　3.验证miR-214-3p与HDAC9的靶向关系。 　　方法： 　　1.采用不同浓度LPS（0、0.1、0.2、0.5、1、2μg/ml）处理大鼠H9C2细胞，24h以后，Real-timePCR检测细胞HDAC9mRNA和miR-214-3p的表达，实验分组：0、0.1、0.2、0.5、1、2μg/ml组。用最适浓度LPS处理H9C2细胞不同时间（0、6、12、24h），Real-timePCR检测细胞HDAC9mRNA和miR-214-3p的表达，实验分组：0、6、12、24h组。 　　2.设计并购买2条HDAC9的siRNA和对照siRNA（siNC），分别转染H9C2细胞，48h后用最适浓度LPS处理H9C2细胞，24h后进行以下检测：Real-timePCR检测HDAC9mRNA和miR-214-3p的表达，Westernblot检测细胞中HDAC9蛋白的表达。试剂盒检测细胞上清中心肌损伤标志物肌钙蛋白（cTnI）（ELISA法）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）（免疫抑制法）、乳酸脱氢酶（LDH）（微板法）的水平；CCK-8检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡；Westernblot检测cleavedcaspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达；ELISA检测H9C2心肌细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平；Westernblot检测IκBα、p-IκBα、p-p65、p65的蛋白表达；免疫荧光检测p65-(+)细胞核的数量。实验分组：Control、LPS、LPS+siNC、LPS+siHDAC9-1、LPS+siHDAC9-2组。 　　3.购买rno-miR-214-3pmimics及其对照NCmimics，分别转染H9C2细胞，48h后用最适浓度LPS处理H9C2细胞，24h后进行以下检测：Real-timePCR检测H9C2细胞中HDAC9mRNA和miR-214-3p表达；Westernblot检测HDAC9的蛋白表达，实验分组：Control、LPS、LPS+NCmimics、LPS+miR-214-3pmimics组。构建含有miR-214-3p结合位点的野生型HDAC9-3''UTR荧光素酶报告载体（HDAC9-wt）以及突变型载体（HDAC9-mut），分别与NCmimics或者miR-214-3pmimics共同转染至H9C2心肌细胞中，双荧光素酶实验验证miR-214-3p和HDAC9的靶向关系。实验分组：HDAC9-wt+NCmimics、HDAC9-wt+miR-214-3pmimics、HDAC9-mut+NCmimics、HDAC9-mut+miR-214-3pmimics组。 　　结果： 　　1在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，HDAC9mRNA水平显著上调，miR-214-3p水平显著下调。在不同浓度LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，随LPS浓度的增加，HDAC9的表达逐渐上调，miR-214-3p的表达逐渐下调。1μg/mlLPS处理H9C2细胞后，随时间点延长，HDAC9表达逐渐升高，miR-214-3p表达逐渐下降。 　　2敲低HDAC9对LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响。 　　2.1在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，LPS组与control组相比，HDAC9的mRNA表达水平显著升高，差异有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+siHDAC9-1和LPS+siHDAC9-2组与LPS+siNC组相比，HDAC9mRNA表达显著下调，差异有明显统计学意义（Plt;0.001）。HDAC9的蛋白表达变化趋势与mRNA的趋势一致。miR-214-3p的表达水平在control组明显升高，在其余四组明显降低，差异有明显统计学意义（Plt;0.001）。 　　2.2在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，LPS组与control组相比，心肌损伤标记物cTnI、CK-MB和LDH表达显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+siHDAC9-1和LPS+siHDAC9-2组与LPS+siNC组相比，心肌损伤标记物cTnI、CK-MB和LDH显著下调，差异具有明显统计学意义（Plt;0.01或Plt;0.001）。 　　2.3在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，LPS组与control组相比，细胞活力显著降低，差异具有明显统计学意义（Plt;0.01）。LPS+siHDAC9-1和LPS+siHDAC9-2组与LPS+siNC组相比，细胞活力显著增加，差异具有明显统计学意义（Plt;0.01）。 　　2.4在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，LPS组与control组相比，细胞凋亡明显增加，cleavedcaspase-3、Bax表达显著升高，Bcl-2表达显著下降，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+siHDAC9-1和LPS+siHDAC9-2组与LPS+siNC组相比，细胞凋亡明显下降，cleavedcaspase-3的表达显著降低，Bcl-2表达显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001），Bax表达显著降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05或Plt;0.01）。2.5在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，LPS组与control组相比，炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+siHDAC9-1和LPS+siHDAC9-2组与LPS+siNC组相比，TNF-α和IL-1β显著下调，差异具有统计学意义（Plt;0.05或Plt;0.01），IL-6显著下调，差异有明显统计学意义（Plt;0.01或Plt;0.001）。 　　2.6在LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，LPS组与control组相比，p-IκBα/IκBα、p-p65/P65的表达显著升高，p65-(+)细胞核比例明显上升，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+siHDAC9-1和LPS+siHDAC9-2组与LPS+siNC组相比，p-IκBα/IκBα、p-p65/P65显著下调，p65-(+)细胞核比例明显下降，差异具有明显统计学意义（Plt;0.01或Plt;0.001）。 　　3H9C2细胞转染rno-miR-214-3pmimics及其对照NCmimics，48h后用1μg/mlLPS处理H9C2细胞，LPS组与control组相比，miR-214-3p的表达水平明显降低，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+miR-214-3pmimics组与LPS+NCmimics组相比，miR-214-3p表达水平显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS组与control组相比，HDAC9mRNA的表达水平显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。LPS+miR-214-3pmimics组与LPS+NCmimics组相比，HDAC9mRNA表达水平显著降低，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。HDAC9蛋白水平的变化与HDAC9mRNA表达水平变化的趋势一致。双荧光素酶实验结果显示miR-214-3p与HDAC9结合，靶向调节HDAC9的表达。 　　结论： 　　1.LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，miR-214-3p表达减少，HDAC9表达增加。 　　2.LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，阻断HDAC9表达之后，心肌细胞损伤标记物下降、活力增加、凋亡减轻、炎症因子水平降低，NF-κB信号通路抑制。 　　3.LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤中，miR-214-3p可以靶向调节HDAC9的表达。 　　第二部分miR-214-3p和HDAC9在LPS诱导的脓毒症大鼠心肌损伤中的研究 　　目的：采用LPS构建脓毒症大鼠模型，观察miR-214-3p和HDAC9在脓毒症心肌损伤中的表达以及对心脏功能、心肌组织的影响。建立HDAC9沉默的脓毒症心肌损伤大鼠模型，观察HDAC9沉默对模型大鼠心脏功能、心肌损伤标志物和炎症因子的影响。 　　方法： 　　1.雄性SpragueDawley大鼠（220-250g），随机分为两组（每组6只）：LPS组和Sham组。LPS组SD大鼠腹腔内注射10?mg/kg的LPS；Sham组给予等体积无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）。6h后，麻醉大鼠并进行经胸超声心动检测左心室射血分数（EF）、左心室缩短分数（FS）、左室舒张末期内径（LVEDD），左室收缩末期内径（LVESD）。随后，安乐处死大鼠，留取左心室组织，Hamp;E染色观察心肌细胞的形态学改变；TUNEL染色法观察心肌组织的凋亡；IF染色形态学观察心肌组织中HDAC9的表达；Westernblot检测心肌组织HDAC9蛋白的表达；Real-timePCR检测心肌组织HDAC9mRNA和miR-214-3p的表达。 　　2.雄性SpragueDawley大鼠（220-250g）随机分为4组（每组6只）：Sham组、LPS组、LPS+shNC组、LPS+shHDAC9组。后两组大鼠用相对应的慢病毒颗粒（1×109TU/ml），进行尾静脉注射，注射体积为150μl。注射7天后，腹腔中注射10mg/kgLPS，Sham组注射等体积的PBS。注射LPS6h后，检测左心室射血分数（EF）、左心室缩短分数（FS），左室舒张末期内径（LVEDD），左室收缩末期内径（LVESD）。安乐处死大鼠，留取左心室组织和血清，Real-timePCR、Westernblot检测心肌组织的HDAC9表达；试剂盒（同第一部分）检测心肌组织中cTnI、CK-MB、LDH的含量；ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达；TUNEL染色法观察心肌凋亡。 　　结果： 　　1.心脏超声结果显示，LPS组大鼠LVEDD和LVESD显著上升，EF和FS显著下降，差异具有明显统计学意义（Plt;0.01或Plt;0.001）。Hamp;E结果显示，LPS组大鼠心肌细胞水肿，心肌纤维排列紊乱。TUNEL结果显示，LPS组大鼠心肌细胞凋亡显著增加。IF结果显示，LPS组大鼠心肌细胞中HDAC9的表达增加。Real-timePCR及Westernblot显示，LPS组相比Sham组，HDAC9mRNA和蛋白的表达水平显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）；miR-214-3p的表达水平显著升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。 　　2.沉默HDAC9表达后，心脏超声结果显示，沉默HDAC9表达可降低LVEDD和LVESD及增强FS和EF，显著改善LPS导致的心脏功能受损。心肌损伤标志物（cTnI、CK-MB和LDH）和炎性细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的水平均降低。TUNEL结果显示，沉默HDAC9表达可减轻心肌细胞凋亡。 　　结论：在LPS诱导的脓毒症大鼠中，HDAC9和miR-214-3p表达升高，形态学显示存在心肌损伤、细胞凋亡增加，心脏超声显示出相应的心脏收缩功能障碍。HDAC9沉默减轻了LPS诱导的脓毒症大鼠的心肌损伤，改善了心功能，降低了炎症反应和心肌细胞凋亡。 　　第三部分miR-214-3p和HDAC9在脓毒症心肌功能障碍患者血清中变化的研究 　　目的：观察脓毒症心肌功能障碍患者血清中miR-214-3p和HDAC9mRNA表达水平的变化及其临床意义。 　　方法：选择沧州市中心医院ICU自2022年4月至2023年2月收治的60例患者作为研究对象，其中脓毒症心肌功能障碍组患者30例（SIMD组），脓毒症组患者30例（NSIMD组），同期招募健康志愿者20例（control组）。所有患者入室后行心脏超声测定，留取血液，化验室检查炎症反应标志物（WBC、PCT）、心肌损伤标志物（CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP）。计算患者APACHEⅡ评分。入选后三组人群各采血2ml离心后取上清液，-80℃冰箱保存，Real-timePCR法测定血清中miR-214-3p和HDAC9mRNA的表达水平。 　　结果： 　　1.SIMD组患者与NSIMD组患者相比，炎症指标（WBC、PCT）、心肌酶学指标（CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP）明显升高，心功能指标（EF、FS）下降，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。APACHEⅡ评分在SIMD组更高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。 　　2.SIMD组和NSIMD组患者与control组相比，血清中miR-214-3p和HDAC9mRNA的表达水平显著升高，差异有明显统计学意义(Plt;0.001)。SIMD组患者和NSIMD组患者相比，miR-214-3p和HDAC9mRNA明显升高，差异具有明显统计学意义（Plt;0.001）。 　　3.SIMD组患者HDAC9mRNA表达水平与EF值呈负相关，与cTnI呈正相关，miR-214-3p与HDAC9表达呈正相关。 　　结论：SIMD和NSIMD组患者心肌损伤和炎症指标升高，且在SIMD组中升高更明显。SIMD组心功能下降。SIMD组HDAC9表达水平与EF呈负相关，与cTnI呈正相关，miR-214-3p与HDAC9表达呈正相关。