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摘要本研究选择正常糖耐量人群通过口服脂肪耐量试验（OFTT），按照空腹血脂和餐后血脂分为不同脂代谢状态人群，以明确脂代谢障碍对于胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的影响；然后进一步用高脂饮食诱导的高脂血症金黄地鼠了解脂代谢紊乱对胰岛β细胞功能的影响；最后利用高脂金黄地鼠模型和棕榈酸（Palmitic acid, PA）干预的MIN6细胞模型，探讨RSV是否可通过逆转胰岛β细胞去分化而防止胰岛β细胞功能受损，为RSV调节糖脂代谢提供新的靶点。<br>　　第一部分 不同脂耐量人群血脂与胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗相关性的研究<br>　　目的：本研究通过行OFTT，比较糖耐量正常但脂代谢状态不同的人群胰岛素分泌和胰岛素抵抗的变化，目的在于探讨脂代谢紊乱对胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的影响，为更早期地预防糖尿病的发生提供可能。<br>　　方法：选取248名口服葡萄糖耐量试验（OGTT）正常的志愿者进行OFTT，根据空腹甘油三酯（TG） 1.7mmol/L及脂餐后4h TG 2.5mmol/L将人群分为三组：①脂耐量正常组（NFT ） ，②脂耐量减低组（IFT）；③高甘油三酯血症组（HTG）。比较不同组之间基线及餐后血脂的变化。采用早期胰岛素分泌功能指数（IGI30）、Homa-β、葡萄糖处置指数（DI）评价胰岛β细胞功能。<br>　　结果：<br>　　1.三组人群基线数据的比较<br>　　三组人群的收缩压、舒张压、腰围、BMI、空腹TG、TC、LDL-C、血糖、胰岛素均随脂耐量减低而逐渐升高，而HDL-C随之降低，三组间差异明显。<br>　　2.三组人群口服脂肪耐量试验餐后血脂变化<br>　　NFT、IFT、HTG三组人群高脂餐负荷后TG达峰时间逐渐延迟，分别为2h、4h、6h。同时在NFT组及IFT组，TG在10h已降至基线水平；而在HTG组，TG在10h仍未降至基线水平。各时间点的TG及TG的曲线下面积（AUC）在三组人群中差异明显。而TG的曲线下面积增量（iAUC）在IFT及HTG两组间无差异。三组人群OFTT期间TC、HDL-C、LDL-C变化幅度不大，且各时间点TC、LDL-C均随脂耐量减低逐渐增高，而HDL-C随之降低。<br>　　小结：<br>　　1.在葡萄糖耐量正常的个体中，β细胞功能和胰岛素敏感性随着脂耐量的下降而逐渐降低。<br>　　2.不仅是空腹TG，餐后TG也是β细胞功能受损和胰岛素抵抗的独立危险因素。<br>　　第二部分 高脂饮食对金黄地鼠胰岛细胞和功能的影响及白藜芦醇的干预研究<br>　　目的：使用高脂饲料喂养金黄地鼠，了解其糖脂代谢情况，并明确其胰岛β细胞的功能状态，给予RSV干预后，验证其是否可以通过逆转胰岛β细胞去分化来改善胰岛β细胞功能。<br>　　方法：将金黄地鼠随机分为2组，对照组（CON）饲喂普通饲料，高脂组（HF）饲喂高脂饲料，饮食干预12周末评估所有金黄地鼠的糖脂代谢情况。动物模型建立成功后，从HF组随机抽取10只给予RSV以100mg/kg/d灌胃，作为高脂+白藜芦醇组（HF+RSV），而CON组及HF组给予0.9%氯化钠注射液灌胃。整个喂养过程中每周监测体重、进食量，每2周经眼底静脉丛采血用血糖仪检测空腹血糖，留取血清用生化法检测血脂；在前期高脂饮食干预的第12周末及后期RSV药物干预的第12周末，分别行腹腔内注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）及在体葡萄糖刺激胰岛素分泌试验（GSIS），通过血糖仪检测不同时间点血糖，同时留取血清以备后期用ELISA法检测胰岛素、胰高血糖素。<br>　　结果：<br>　　1.高脂饮食喂养12周金黄地鼠的代谢评估<br>　　HF组的金黄地鼠从高脂喂养第2周开始至第12周结束体重均明显高于CON组。同时，HF组的金黄地鼠TC、TG、HDL-C从高脂喂养的第2周开始，LDL-C从第8周开始，至12周结束均明显高于CON组。在整个高脂饮食喂养的造模过程中，HF组和CON组的空腹血糖无明显差异。但是，在第12周末行IPGTT ，可见HF组糖负荷后各时间点血糖、2h AUCglu及2h iAUCglu均较CON组明显升高，存在糖耐量减低。HF组在空腹、高糖负荷后各时间点的胰岛素及2h AUCins、2h iAUCins均较CON组明显升高，提示存在高胰岛素血症。但在GSIS试验中，HF组糖负荷后2min胰岛素及5min iAUCins反而较CON组明显减少，提示HF组金黄地鼠胰岛β细胞第一时相胰岛素分泌功能下降。进一步计算验证了HF组的Homa-IR明显高于CON组，QUICKI、IGI30、DI明显低于CON组。另外，在IPGTT中，虽然空腹胰高血糖素在两组间无明显差异，但是HF组糖负荷后各时间点的胰高血糖素均高于CON组，且HF组2h AUCglucagon也较CON组明显升高，提示HF组金黄地鼠在高糖负荷后胰高血糖素分泌抑制明显受损，引起餐后高胰高血糖素血症，进一步加重糖耐量减低。<br>　　2.在高脂饮食喂养的基础上，白藜芦醇药物干预12周后金黄地鼠的代谢评估<br>　　在高脂饮食喂养的基础上，RSV干预后从第7周开始至第12周结束HF+RSV组的体重均明显低于HF组，但仍明显高于CON组。并且HF+RSV组的TC、TG从RSV干预后第4周起，LDL-C从RSV干预后第8周起均明显低于HF组，此差异一直持续至第12周结束。但是HDL-C在整个RSV干预过程中虽HF+RSV组稍低于HF组，但差异无统计学意义。在RSV干预12周末，HF组的游离脂肪酸（FFA）较CON组明显升高，而HF+RSV组的FFA较HF组明显下降。另外，在RSV干预过程中，三组间的空腹血糖仍无明显差异。在RSV干预后的第12周末再次行IPGTT，可见HF+RSV组糖负荷后各时间点的血糖及2h AUCglu、2h iAUCglu均明显低于HF组。同时，IPGTT中HF+RSV组空腹及糖负荷后各时间点胰岛素、2h AUCins、2h iAUCins均明显低于HF组。在RSV干预12周后再次行GSIS试验，HF+RSV组糖负荷后2min胰岛素及5min iAUCins均明显高于HF组。进一步计算可知HF+RSV组Homa-IR明显低于HF组，而QUICKI、IGI30、DI明显高于HF组。提示RSV可改善高脂饮食喂养的金黄地鼠胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，提高胰岛β细胞功能。另外，在IPGTT中，HF+RSV组糖负荷后各时间点胰高血糖素及2h AUCglucagon明显低于HF组。<br>　　小结：<br>　　1.高脂饮食诱导的脂代谢异常金黄地鼠可表现胰腺组织脂质沉积，导致胰岛β细胞和α细胞功能受损，以及胰岛素抵抗。<br>　　2.白藜芦醇能改善高脂饮食诱导的金黄地鼠糖脂代谢紊乱、胰岛功能和胰岛素抵抗；逆转高脂诱导的胰岛β细胞去分化，通过调控PI3K/Akt/FOXO1信号通路可能是其实现该作用的机制。<br>　　第三部分 白藜芦醇通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路调节棕榈酸诱导的MIN6细胞去分化<br>　　目的：通过在体外用PA诱导MIN6细胞，在细胞水平上验证RSV是否可通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路调节胰岛β细胞的去分化。<br>　　方法：通过用不同浓度的PA及RSV分别干预并培养MIN6细胞，利用CCK-8法检测各组细胞存活率，从而选取最终合适的PA造模浓度及RSV干预浓度。用0.3mmol/L PA孵育MIN6细胞24h后，再用10μmol/L RSV联合干预24h后行油红O染色。进一步联合PI3K抑制剂LY294002 10μmol/L进行干预，最终分为5组：对照组（CON）、棕榈酸组（PA）、棕榈酸+白藜芦醇组（ PA+RSV ）、棕榈酸+白藜芦醇+PI3K抑制剂组（PA+RSV+LY）、棕榈酸+PI3K抑制剂组（PA+LY）。对上述五组进行GSIS试验，用ELISA法检测各组在GSIS试验中的胰岛素。最后通过RT-PCR和免疫荧光染色检测胰岛β细胞功能及去分化标志物，并用Western blot法检测PI3K/Akt/FOXO1信号通路的关键分子蛋白及磷酸化表达水平。<br>　　结果：<br>　　1.确定棕榈酸造模浓度及白藜芦醇的药物干预浓度<br>　　首先分别用不同浓度的PA干预MIN6细胞，通过CCK-8法检测MIN6细胞的存活率，同时结合PA干预后MIN6细胞的镜下表现，最终选择0.3mmol/L作为后续试验中PA诱导MIN6细胞建立脂毒性模型的干预浓度。<br>　　然后再用不同浓度的RSV分别干预MIN6细胞及PA干预的MIN6细胞，通过CCK-8法检测细胞的存活率。在PA干预的基础上， RSV 10μmol/L可使细胞存活率较PA组显著增加，故最终选择10μmol/L作为RSV药物干预浓度。<br>　　2.白藜芦醇干预可改善棕榈酸诱导MIN6细胞的镜下形态<br>　　在PA干预的基础上，联合RSV处理后PA+RSV组细胞镜下形态较PA组明显改善，漂浮及脱落细胞减少，细胞形态趋于正常，大部分细胞重新长出长尾和角。<br>　　小结：白藜芦醇可通过激活PI3K/Akt/FOXO1信号通路，抑制FOXO1的核聚集，而发挥逆转PA诱导的胰岛β细胞去分化的作用。<br>　　结论：<br>　　1.空腹和餐后TG升高均是β细胞功能受损和胰岛素抵抗的独立危险因素。<br>　　2.高脂饮食诱导的脂代谢异常金黄地鼠可表现胰腺组织脂质沉积，导致胰岛β细胞和α细胞功能受损，以及胰岛素抵抗。