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摘要细胞表面分布着多种可指示细胞状态的小分子，其含量的变化通常是表征细胞健康与否的指标，因此定量分析细胞表面的指示分子对某些疾病诊断和治疗起着重要作用。目前针对细胞表面疾病标志物成像和定量的分析手段主要有荧光成像、高效液相色谱法、质谱法、电化学以及表面增强拉曼光谱等。在以上检测方法中，一些方法尽管具有nM级的检出限，但需要复杂的预处理过程和相对较大的样本量，并且无法对活细胞中的标志物进行非破坏性和实时的分析；另一些适用于动态分析的方法，但检出限较高，灵敏度不够。因此，在单细胞水平上以分子级的灵敏度实时成像和定量细胞表面疾病标志物仍然是一项具有挑战性的任务。基于此，本文通过合成特异性标志物识别分子并将其功能化于原子力显微镜（AFM）微悬臂针尖上，同时利用具有亚纳米分辨率和皮牛级灵敏度的单分子力谱（SMFS）技术结合液相模式，在生理条件下实现对细胞表面特异性识别分子、气体信号分子以及细胞膜结构分子的成像和定量检测。<br>　　（1）细胞膜表面磷脂酰丝氨酸（PS）产生及浓度差异化在细胞凋亡过程中起着重要的作用。本章利用SMFS技术对PS进行单分子成像及定量。其设计依托Zn(II)二吡啶胺配合物（ZnDPA）与PS的特异性结合和可逆相互作用。将硫辛酸功能化的ZnDPA（LP-ZnDPA）由Au-S键作用固定在AFM微悬臂针尖上，形成力响应探针ALP-ZnDPA，通过力响应实现PS特异性的动态成像和检测。首先，构建囊泡对针尖修饰LP-ZnDPA浓度和探针ALP-ZnDPA响应pH值进行优化，结果表明修饰针尖的最适浓度为0.5μM，最适pH值为7.4，此时的粘附力最大为32.57±4.17pN。接着，采用优化后的条件测试探针ALP-ZnDPA与含有0-60%的1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（POPS）组成囊泡的相互作用力，得到力（y）与PS分子数（x）的标准曲线方程：y=8.32×10-5x+13.17，检出限为1.86×104个PS分子。最后，将该方法用于分析不同种癌细胞（MCF-7、A549和HepG2）及其对应的正常细胞和紫杉醇诱导HeLa细胞程序性凋亡过程中不同阶段PS的表达水平，结果显示，与各自对应的癌细胞相比，正常细胞PS含量明显较低，且凋亡过程中细胞膜上PS分子数逐渐增加。本章首次应用力探针定量单个细胞表面的PS分子，并从分子水平上深入分析了细胞凋亡过程中PS含量的动态变化。<br>　　（2）细胞表面一氧化碳（CO）含量高低与心血管、败血症、癌症等疾病密切相关。本章利用SMFS技术对CO进行单分子成像及定量。依据金属钯配合物催化羰基化反应，将硫辛酸功能化的识别分子COP（LP-COP）由Au-S键作用固定在AFM微悬臂针尖上，并利用生物素与亲和素的特异性结合连接在细胞表面，形成力响应探针ALP-COP，通过力响应实现CO特异性的动态成像和检测。首先，构建囊泡模型对针尖修饰LP-COP浓度进行优化，结果表明修饰针尖的最佳浓度为0.5μM，此时的破裂力最大为25.52±12.76pN。接着，采用优化后的条件测试探针ALP-COP与添加不同浓度的一氧化碳释放剂（CORM-2）囊泡的相互作用力，得到力（y）与CO分子数（x）的标准方程：y=62.14-2.16×10-4x，检出限为1.05×104个CO分子。最后，分析不同细胞（HepG2、HeLa和A549）在正常和缺氧培养条件下以及HeLa细胞在脂多糖（LPS）刺激和原卟啉锌（ZnPP）抑制下CO的释放量，结果显示，缺氧情况下CO的生成量明显较多，且加入LPS和ZnPP后释放的CO分子数有明显改变。以上结果证明SMFS技术对实时动态检测CO释放量的可行性。<br>　　（3）细胞膜结构分子鞘氨醇（Sphingosine,Sph）代谢异常见于癌症、阿尔茨海默氏症、溶酶体贮积病等多种疾病。本章利用SMFS技术对Sph进行单分子成像及定量。依据水杨醛酯与鞘氨醇末端1,2-氨基醇反应的化学特性，设计了探针LP-SphP，并由Au-S键作用固定在AFM微悬臂针尖表面，形成力响应探针ALP-SphP，通过力响应实现Sph特异性的动态成像和检测。首先，构建囊泡对针尖修饰LP-SphP浓度和探针ALP-SphP响应pH值进行优化，结果表明修饰针尖的最佳浓度为0.5μM，此时的粘附力最大为40.99±6.32pN，最佳pH值为6.6，此时粘附力为40.62±8.12pN。接着，采用优化后的条件测试探针ALP-SphP与不同Sph浓度囊泡的相互作用力，得到力（y）与Sph分子数（x）的标准曲线方程为y=1.82×10-3x+11.29，检出限为1.65×104个Sph分子。最后，通过分析不同细胞（HeLa、MCF-7和MCF-10A）以及刺激剂阿霉素（Doxorubicin）和肿瘤坏死因子α（TNFα）作用后MCF-7细胞表面Sph的表达水平，结果显示，癌细胞比正常细胞Sph含量更高，且刺激剂导致Sph含量明显增加。本章首次应用力探针定量单个细胞表面的Sph分子，并从分子水平上深入分析了刺激剂诱导下Sph含量的动态变化，为当前的检测方法引入了一个新的维度。