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摘要目的：探索自噬蛋白ATG8（autophagy protein，ATG8）在艾美游仆虫（Euplotes amieti）中的细胞定位，干扰艾美游仆虫EaATG8基因的表达，并从纤毛和皮层细胞骨架的角度探索EaATG8在纤毛虫中的功能。<br>　　方法：构建RNAi表达载体pL4440-EaATG8并转化至RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌（E.coli HT115），采用喂食法将大肠杆菌导入艾美游仆虫细胞中。设置对照组（control 组，空质粒组）和干扰组（EaATG8RNAi组，含有EaATG8基因片段的干扰表达载体组）。利用RT-qPCR和WB技术分别检测自噬蛋白EaATG8和纤毛装配相关蛋白IFT88的表达变化。利用 FLUTAX 直接荧光标记显示艾美游仆虫纤毛及其附属微管的胞器结构的变化，免疫荧光观察 EaATG8 在艾美游仆虫中的细胞定位及 EaATG8 与gamma-tubulin 在细胞中的共定位变化。绘制生长曲线观察艾美游仆虫的生长趋势，通过转录组测序比较差异表达基因。透射电镜观察纤毛等细胞器的超微结构变化，采用细胞追踪方法测定其游动速度和游动轨迹。<br>　　结果：ATG8 蛋白在纤毛虫和其他原生动物以及在人类中蛋白序列都相对保守；FLUTAX荧光结果显示艾美游仆虫腹面纤毛微管胞器由口围带（AZM，adoral zone of membranelles）、波动膜（UM，undulating membranes）、9根额腹棘毛（FVC，frontal ventral cirrus）、5根横棘毛（TC，transverse cirri）、2根缘棘毛（MC， marginal cirri）、和 2 根尾棘毛（CC，caudal cirri）、以及额腹横棘毛的前纵微管束（AF，anterior longitudinal fiber）、后纵微管束（PF，posterior longitudinal fiber）和放射微管束（RF， radiating fiber）构成。背纤毛器微管胞器由8～9列背触毛基体构成。EaATG8不仅定位于艾美游仆虫背面的背触毛基体，且定位于腹部口围带、波动膜、以及额腹横棘毛与尾棘毛基部。经测序比对与RT-qPCR验证pL4440-EaATG8干扰表达载体构建成功。喂食法将大肠杆菌导入艾美游仆虫细胞中，生长曲线显示，对照组中艾美游仆虫数量逐渐增加至一定数量后保持不变，而干扰组艾美游仆虫存活数量持续下降，至第 10天，几乎全部死亡。RT-qPCR和WB结果显示，干扰组中艾美游仆虫的EaATG8表达显著下调（P＜0.01），成功干扰了艾美游仆虫中EaATG8基因的的表达。干扰后免疫荧光结果显示，随着干扰天数的增加，艾美游仆虫背面和腹面EaATG8的阳性标记不断减少。FLUTAX 标记显示，在干扰 1 天时，艾美游仆虫中纤毛基部附属微管束消失，其他胞器结构完整；干扰3天时，除纤毛基部附属微管束消失外，FVC、TC、CC等微管胞器均解聚；在第5-7天时，AZM结构不再完整。而gamma-tubulin标记结果显示，当细胞被干扰到第7天时，纤毛基体几乎无法显示。干扰后透射电镜结果显示，对照组中，艾美游仆虫背皮层下胞内基质均匀，线粒体数量丰富，内膜结构完整，背侧三层微管单元呈倒“品”字形叠加，排列整齐，分布均匀。在干扰组中，随着干扰天数的增加，艾美游仆虫背皮层下胞质结构逐渐稀疏，电子密度减低，线粒体数量减少，内膜瓦解，背侧三层微管单元减少或消失。口围带小膜的基体列在对照组中排列成3列，纤毛内微管结构正常。而干扰组中减少为2列，且部分纤毛内微管变形。进一步通过转录组测序显示，EaATG8基因表达受到干扰后，7966个基因表达上调， 4055个基因表达下调，差异基因KEGG和GO富集分析发现差异基因主要富集在生长和死亡、细胞运动、运输和分解代谢与分子之间相互作用等通路。WB结果验证纤毛装配相关蛋白IFT88的表达显示下调，可见ATG8通过IFT88等蛋白参与了纤毛的装配和维持皮层纤毛器微管胞器的结构稳定。此外，艾美游仆虫的泳动轨迹和速度测定结果显示，对照组艾美游仆虫呈直线运动状态良好，但干扰组细胞在干扰1天，3天，5天和7天时做半径逐渐减小的圆周运动，到第7天，它基本上在原地盘旋。随着干扰的天数增加艾美游仆虫的泳动速度下降十分明显，第5-7天时，基本不再游动。<br>　　结论：首先，EaATG8定位于艾美游仆虫背触毛基体和腹棘毛基部；其次， EaATG8蛋白不仅具有维持纤毛结构完整性的作用，而且还参与纤毛胞器和背皮层下纤毛骨架系统的构建；RNA干扰EaATG8基因的表达导致纤毛内运输蛋白IFT88降解，从而抑制纤毛生成；EaATG8的敲低使纤毛运动功能受到障碍，影响纤毛摆动，从而影响纤毛的泳动速度和模式，进而导致艾美游仆虫的死亡。