检索历史 清除

摘要目的：<br>　　肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，病情发展快。占我国恶性肿瘤发病的第三位，肿瘤死亡的第二位。为了改善肝细胞癌的预后和治疗，人们一直在致力于研究导致肝细胞癌细胞恶性转化及肝细胞癌发生发展的细胞及分子生物学机制，希望能发现新的治疗靶点。SLC26A6（也称PAT-1或CFEX）是阴离子转运通道家族的成员，其主要功能是介导上皮细胞的Cl-/HCO3-转运。我们课题组先前研究已证实SLC26A6可以促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。本项目旨在进一步在动物水平对SLC26A6在肝细胞癌中的作用进行验证，进而探索SLC26A6影响肝癌的分子机制，为肝细胞癌的诊断、治疗和预后提供新的方向和策略。<br>　　方法：<br>　　第一部分：肝脏特异性过表达SLC26A6基因鼠相关实验<br>　　1. 委托广州塞业公司构建肝脏特异性过表达 SLC26A6 的转基因小鼠，运用Southern-Blot、qRT-PCR、Western-Blot 技术验证肝脏中 SLC26A6 过表达情况。<br>　　2. 绘制过表达小鼠及对照小鼠出生后3、6、9、12、15、18、21、24月的体重变化，并绘制生长体重曲线图。<br>　　3. 与野生型小鼠相比，观察3、6、9、12、15、18、21、24月过表达基因小鼠肝脏形态学变化，以及运用 HE 染色、油红染色、天狼星染色观察过表达基因鼠肝脏组织学上的变化。<br>　　4. 通过组织亚器官提取实验和氯离子检测实验，检测过表达SLC26A6小鼠肝脏细胞内各亚器官氯离子浓度。<br>　　5. 通过蛋白组学技术对SLC26A6潜在靶点以及信号通路进行筛选预测。<br>　　6. 通过 qRT-PCR、Western-Blot 技术验证潜在靶点以及信号通路差异性蛋白的表达情况。<br>　　第二部分：腺相关病毒过表达SLC26A6小鼠肝癌模型相关实验<br>　　1. 委托上海吉凯基因技术有限公司构建SLC26A6过表达的腺相关病毒（AVV），我们通过尾静脉注射过表达以及对照病毒构建过表达 SLC26A6 小鼠及对照组小鼠，并进一步建造 DEN+CCL4肝癌模型。运用 qRT-PCR、Western-Blot技术验证肝脏中SLC26A6过表达情况。<br>　　2. 通过病理组织 HE 染色、天狼星染色观察小鼠肝脏组织学上纤维化、肿瘤形成率等病理学的情况。<br>　　3. 通过 Western-Blot 技术进一步在腺相关病毒肝癌模型中验证相关表型以及信号通路相应蛋白的表达情况。<br>　　第三部分：细胞实验<br>　　1. 运用慢病毒转染技术在肝细胞癌细胞SK-HEP1中过表达SLC26A6，通过qRT-PCR技术、Western-Blot技术验证转染效率。<br>　　2. 通过qRT-PCR技术检测过表达SLC26A6基因的SK-Hep1细胞脂代谢表型以及信号通路相应差异性蛋白mRNA水平的表达情况。<br>　　3. 通过活性氧检测实验，检测过表达SLC26A6基因组以及对照组SK-Hep1细胞ROS（活性氧）值。<br>　　结果：<br>　　第一部分：<br>　　1. Southern-Blot、qRT-PCR、Western-Blot结果表明与对照野生型小鼠相比，转基因小鼠肝脏成功过表达SLC26A6（Plt;0.0001,Plt;0.0001,Plt;0.001）。<br>　　2. 记录过表达小鼠及对照小鼠出生后3、6、9、12、15、18、21、24月的体重变化，并绘制生长体重曲线图。结果显示：与对照野生型小鼠相比过表达SLC26A6小鼠的体重可在9月后小鼠显著增加。<br>　　3. 与野生型小鼠相比，过表达基因小鼠肝脏形态学变化结果显示：（1）肝脏组织图片结果显示，12 月时过表达 SLC26A6 小鼠肝脏呈显著脂肪肝表型；并且18后可陆续呈现肿瘤的发生。（2）肝脏组织HE染色结果显示，6月时过表达 SLC26A6 小鼠肝脏结构呈现有细胞水肿以及炎症的发生；12 月时过表达SLC26A6 小鼠肝脏结构呈现有脂肪空泡以及轻微纤维化的发生；18 月时及以后过表达SLC26A6小鼠肝脏结构呈现有组织结构致密、细胞排列紊乱、具有肿瘤组织的病理特征。（3）肝脏组织油红染色结果显示，在9月-15月期间过表达SLC26A6小鼠肝脏组织呈现有大量脂滴形成。（4）肝脏组织天狼星染色结果显示，在15月以及以后期间过表达SLC26A6小鼠肝脏结构呈现纤维化显著增加。<br>　　4. 过表达SLC26A6基因组小鼠可增加细胞质、线粒体、内质网氯离子浓度。<br>　　5. 基因芯片、蛋白组学结果显示：小鼠肝脏特异性过表达SLC26A6基因后可影响脂代谢相关基因以及Ppara信号通路显著变化。<br>　　6. Western-Blot实验检测脂代谢相关标志物结果显示：小鼠肝脏特异性过表达过表达SLC26A6基因后上调了肝脏脂代谢和Ppara信号通路相关蛋白Ppara、Fabp2、Acot2、Cidea等的表达。提示SLC26A6是通过影响肝脏组织脂肪代谢进一步促进了肝细胞癌的发生发展。<br>　　第二部分：<br>　　1. qRT-PCR、Western-Blot结果表明与对照腺相关病毒肝癌模型组小鼠相比，过表达 SLC26A6 腺相关病毒肝癌模型组小鼠肝脏成功过表达 SLC26A6 （Plt;0.05,Plt;0.001）。<br>　　2. 与对照腺相关病毒肝癌模型组小鼠相比，过表达SLC26A6腺相关病毒肝癌模型组小鼠肝脏形态学变化结果显示：（1）肝脏组织 HE 染色结果显示，过表达SLC26A6腺相关病毒肝癌模型组小鼠肝脏呈现更严重的组织结构致密、细胞排列紊乱等肿瘤组织的病理特征。（2）肝脏组织天狼星染色结果显示，过表达 SLC26A6 腺相关病毒肝癌模型组小鼠肝脏呈现更严重的纤维化病理特征。<br>　　7. Western-Blot实验验证脂代谢相关标志物结果显示：过表达SLC26A6腺相关病毒肝癌模型组小鼠上调了肝脏脂代谢和 Ppara 信号通路相关蛋白 Ppara、Fabp2、Acot2、Cidea。提示 SLC26A6 是通过影响肝组织脂肪代谢进一步促进了肝细胞癌的发生发展。<br>　　第三部分：<br>　　1. qRT-PCR 结果表明与空转对照组相比，SK-Hep1 细胞成功过表达 SLC26A6 （Plt;0.0001），Western-Blot结果表明与空转对照组相比，SK-Hep1细胞成功过表达SLC26A6。<br>　　2. qRT-PCR实验检测脂代谢相关标志物结果显示：过表达SLC26A6上调了SK-Hep1 肝癌细胞脂代谢相关基因 Ppara、Acot2、Mest、Acss3 等的表达（Plt;0.01,Plt;0.05，Plt;0.0001，Plt;0.001）。提示SLC26A6是通过影响肝细胞脂肪代谢进一步促进了肝细胞癌的发生发展。<br>　　3. ROS活性氧检测实验结果显示，过表达SLC26A6显著上调了SK-Hep1肝癌细胞的活性氧水平，即进一步产生了氧化应激促进肝细胞癌的发生发展。<br>　　结论：<br>　　小鼠肝脏过表达 SLC26A6 可以引起肝脏的病理学变化，如脂肪肝的发生、纤维化以及肿瘤的发生。小鼠肝脏过表达SLC26A6可以增加肝细胞内细胞质、内质网、线粒体亚器官的氯离子浓度。SLC26A6可以显著上调自然生长小鼠肝组织的脂代谢相关基因以及蛋白的表达。肝癌模型中小鼠过表达SLC26A6可以加重肝脏纤维化的形成以及加快肿瘤的发生。在动物水平和细胞水平， SLC26A6 可以显著上调正常肝细胞的脂代谢相关基因及蛋白的表达，进一步可发生氧化应激促进肝细胞癌的发生发展。