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摘要目的：研发出一种基于双链特异性核酸酶（Duplex-specificnuclease，DSN）特殊酶切作用与CRISPR-Cas12a系统反式剪切活性的非小细胞肺癌（NSCLC）相关miRNA的高灵敏、高特异的检测新方法。<br>　　方法：特异性设计与合成DSN酶切miRNA/DNA杂交双链中的DNA（DNA捕获序列），并构建DSN激活CRISPR-Cas12a反式剪切活性的靶标miRNA检测新方法。本研究还探索了crRNA和DNA捕获序列之间的碱基错配对Cas12a的反式切割效率的影响。我们采用电泳法和荧光分光光度法对新方法的关键实验步骤进行了表征，并通过荧光分光光度计分析了整个方案的可行性。并对新方法实验中的关键参数进行多方面优化：包括DNA捕获序列浓度、DSN反应量、DSN孵育温度、DSN孵育时间、Cas12a反应浓度、crRNA浓度、荧光探针浓度等，以获得最佳检测信噪比。在最适实验条件下对miRNA检测新方法进行一系列的方法学评价：检测线性范围与最低检测限、特异性分析及回收率能力检测等。本研究最后收集NSCLC患者和健康体检志愿者的血清样本各4例，提取出总RNA分别利用新方法和qRT-PCR对其中miR-let-7a进行临床实际样本检测。<br>　　结果：本研究发现crRNA互补ssDNA5’-端的第3-4位的2个碱基错配为模板的DNA捕获序列具有最高的信噪比。通过电泳、分光光度法成功地验证出整体方案的可行性。新方法的实验条件优化结果表明：Cas12a和crRNA的最佳浓度分别为：100nmol/L、300nmol/L，荧光探针浓度为1μmol/L，最佳DSN反应条件中DSN含量为0.4U，DNA底物浓度10nmol/L，DSN反应温度为50℃，DSN反应时间为2h。新方法的方法学评价显示：线性检测范围为0.1-100pmol/L（R2=0.997），最低检测限低为62.78fmol/L，表明新方法检测灵敏度较高；只有当靶序列miR-let-7a存在时才能激活新方法的DSN反应，说明构建新方法具有良好的特异性；对于1nmol/L、100pmol/L、1pmol/L三种不同浓度的靶标分子进行6次独立实验，其相对标准偏差（RSD）分别为5.51%、2.30%、3.50%，表明此方法稳定性较好；在复杂生物样本（10%正常人血清）中加入1、5和50pmol/L浓度的靶标miRNA测得的回收率在96%~114%之间，表明新方法在复杂基质中回收率高且具有临床检测的潜力。所有的8例临床血清样本实际检测的结果证实：新方法对miR-let-7a的定量检测结果与qRT-PCR测得的结果相比基本一致（R2=0.986），提示出新的检测方法在临床样本中具有良好的实际应用潜力。<br>　　结论：本研究成功开发出一种基于DSN的特殊酶切作用与CRISPR-Cas12a反式剪切活性的增强型NSCLC特异性miRNA的荧光检测新方法。具有较好的灵敏度、特异性与回收率检测能力，并且能够在NSCLC患者中进行临床实际样本检测，为非小细胞肺癌等恶性肿瘤的早期筛查、预后监测等方面提供了潜在的技术工具和研究策略。