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摘要结核病（Tuberculosis,TB）是结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，M.tb）侵入肺部导致机体受损的一种慢性传染性疾病，它是导致人类死亡的主要传染病之一。然而卡介苗作为全球唯一被广泛认可并接种的结核疫苗，为儿童提供了成功的免疫保护，但对于发病群体人数最多的成年人，保护效力却是极其微弱的，并且随着结核耐药的流行，开发一种能够对人体产生持久保护效力和对各个年龄的不同群体都有预防效果的结核疫苗十分紧迫。随着对结核疫苗的深入研究和技术的不断进步，越来越多的结核疫苗被合理设计并进入临床试验，但至今尚无有效的新的结核预防性疫苗问世，全球结核病的流行并未得到有效的控制。这很可能是疫苗保护效率不足的问题，因此实施优化疫苗免疫途径结合新型免疫佐剂的策略有可能增强疫苗的免疫原性，提高疫苗对结核病的免疫保护性和免疫治疗效果。本课题组在前期研究中成功地研发了结核分枝杆菌ag85abDNA疫苗，并且已经证明对小鼠结核病的治疗是安全、有效的，但是考虑到DNA疫苗在大型动物和人体内普遍存在明显的免疫原性不足的问题，因此本课题组前期采取了结核分枝杆菌ag85abDNA疫苗肌肉注射结合电导入的免疫方法，发现电导入方法成功地减少了DNA疫苗的用量，增强了疫苗的免疫原性，对小鼠结核感染模型具有良好的免疫治疗效果。考虑到M.tb是通过呼吸道侵入肺部粘膜进而引起机体感染的，肺部粘膜是预防结核感染的第一道防线，而且肺部存在庞大的吸收面积和众多的免疫细胞，肺黏膜免疫可增强肺部局部免疫并清除病原菌。因此，本研究以ag85abDNA疫苗肌肉注射电导入途径为对照，通过手持式液体气溶胶肺部递送装置进行ag85abDNA疫苗的肺部免疫，比较两种免疫途径的免疫原性，确定哪种途径能够更有效地诱导机体及肺局部产生更强的免疫应答，为建立有效的DNA疫苗递送系统奠定基础。<br>　　将50只BALB/c小鼠随机分成PBS肌肉注射+电导入组（PBS+EP组）、pVAX1（整合质粒，可以作为一种疫苗的载体）载体肌肉注射+电导入组（pVAX1+EP组）、ag85abDNA疫苗肌肉注射+电导入组（ag85ab+EP组）、pVAX1载体肺递送组（pVAX1+PD组）和ag85abDNA疫苗肺递送组（ag85ab+PD组），每组10只。分别采用肌肉注射电导入和肺部递送两种方式免疫小鼠，每2周免疫1次，共免疫3次，于末次免疫后6周和12周分别杀鼠6只和4只，记录小鼠的体重变化，用酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）检测小鼠血浆中IgG、IgG1和IgG2a特异性抗体水平和肺泡灌洗液IgA抗体水平；用酶联免疫斑点试验（enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT）检测肺淋巴细胞和脾细胞中分泌干扰素-γ（IFN-γ）的效应淋巴细胞斑点数；用流式细胞术检测小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的比例，用Luminex方法检测肺和脾淋巴细胞培养上清中Th1、Th2和Th3细胞因子的水平。<br>　　末次免疫后第6周和12周，ag85ab+EP组产生的血浆特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平均显著高于ag85ab+PD组（P＜0.001）。<br>　　末次免疫后第6周，ag85ab+PD组小鼠肺泡灌洗液中产生的特异性抗体IgA水平显著高于ag85ab+EP组（P＜0.001）。末次免疫后第12周，ag85ab+PD组产生的特异性抗体IgA水平显著高于PBS+EP组（P＜0.05）。<br>　　末次免疫后第6周ag85ab+PD组分泌IFN-γ的肺T淋巴细胞数比ag85ab+PD组高2倍（P＜0.0001）。与末次免疫后第6周比较，第12周ag85ab+EP组和ag85ab+PD组分泌IFN-γ的脾淋巴细胞斑点数均显著降低（P＜0.0001，P＜0.001）。但ag85ab+PD组与ag85ab+EP组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）；。<br>　　末次免疫后第6周，ag85ab+PD组和ag85ab+EP组小鼠脾细胞中的FoxP3调节性T细胞的比例均显著高于PBS+EP组（P＜0.05）。末次免疫后第12周，ag85ab+PD组和ag85ab+EP组小鼠脾细胞FoxP3调节性T细胞的比例显著高于PBS+EP组和pVAX1+PD组（P＜0.001或P＜0.01）。末次免疫后第6周和12周，ag85ab+PD组和ag85ab+EP组间差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　在肺淋巴细胞培养上清产生的Th1型细胞因子中，ag85ab+PD组IFN-γ、白细胞介素（IL-2）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、活性白细胞介素12（IL-12P70）、白细胞介素18（IL-18）、白细胞介素27（IL-27）的水平显著高于PBS+EP组、pVAX1+EP组和pVAX1+PD组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）；ag85ab+PD组IFN-γ、IL-12P70、IL-18、IL-27的水平均显著高于ag85ab+EP组（P＜0.001，P＜0.0001）。需要特别指出的是肺递送途径肺淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平是肌肉注射电导入途径的4倍。<br>　　在肺淋巴细胞培养上清产生的Th2型细胞因子中，ag85ab+PD组白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素9（IL-9）、白细胞介素10（IL-10）和白细胞介素13（IL-13）水平显著高于PBS+EP组和pVAX1+PD组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01或P＜0.0001）；ag85ab+PD组IL-10显著高于疫苗肌肉注射+电导入组（P＜0.001）。Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）的比值结果表明，ag85ab+PD组的Th1/Th2比值比ag85ab+EP组高2倍。<br>　　在肺淋巴细胞培养上清产生的Th3型细胞因子中，ag85ab+PD组和ag85ab+EP组白细胞介素17A（IL-17A）和白细胞介素22（IL-22）水平显著高于其他组（P＜0.001或P＜0.0001）。但ag85ab+PD组和ag85ab+EP组间差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　在脾淋巴细胞培养上清产生的Th1型细胞因子中，ag85ab+PD组和ag85ab+EP组IFN-γ、IL-2、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、GM-CSF、IL-12P70和IL-18水平均显著高于PBS+EP组和pVAX1+EP组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001），需要特别指出的是ag85ab+PD组脾淋巴细胞培养上清中IL-2和TNF-α水平显著高于ag85ab+EP组（P＜0.05）。<br>　　在脾淋巴细胞培养上清产生的Th2型细胞因子中，ag85ab+PD组和ag85ab+EP组IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13水平显著高于PBS+EP组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。值得注意的是ag85ab+PD组脾淋巴细胞培养上清中IL-6水平显著高于ag85ab+EP组（P＜0.05），而IL-10水平则显著低于ag85ab+EP组（P＜0.0001）。Th1/Th2（IFN-γ/IL-4）的比值结果表明ag85ab+EP组比ag85ab+PD组高1倍。<br>　　在脾淋巴细胞培养上清产生的Th3型细胞因子中，ag85ab+PD组脾淋巴细胞培养上清中IL-17A和IL-22水平显著高于ag85ab+EP组（P＜0.001或P＜0.0001）。<br>　　综上所述，结核分枝杆菌ag85abDNA疫苗肺递送途径和肌肉注射电导入途径均能有效诱导肺脏和脾脏效应T淋巴细胞分泌IFN-γ，但是肺递送途径能够诱导的效应T细胞数更多、反应更强。不仅如此，两种递送途径都可以诱导机体肺和脾淋巴细胞产生Th1和Th3型细胞免疫占优势的细胞免疫反应。肌肉注射电导入免疫途径可以诱导机体产生较高水平的特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a，最为重要的是，肺递送途径较肌肉注射电导入途径能够诱导呼吸道粘膜产生更高水平的特异性抗体IgA。总之，DNA疫苗肺递送免疫比肌肉注射电导入免疫能更有效地刺激机体产生较强的细胞免疫和粘膜免疫，尤其是肺脏局部的细胞免疫，能显著增强ag85abDNA疫苗的免疫原性，是一条可行且有效的免疫接种途径。