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摘要背景：<br>　　多发性硬化（multiplesclerosis，MS）是以CNS白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。目前已批准上市的DMT药物疗效有限，也可能导致恶性肿瘤及机会性感染等的发生。因此，积极探索新的免疫调节方法具有重要的科学价值。<br>　　树突状细胞（dendriticcells，DCs）是体内最重要的专职抗原呈递细胞，在免疫耐受的构建和维持中发挥关键作用，与MS的发生和发展密切相关。体外诱导耐受性DCs回输治疗能够明显改善EAE，但因其流程复杂、费用高昂，且回输治疗可能出现严重的不良反应，限制了其临床转化。<br>　　程序性死亡受体-1（programmedcelldeath1，PD-1）是一种免疫抑制性受体，广泛表达于T、B细胞及DCs等各类免疫细胞表面，程序性死亡受体-配体1（programmedcelldeathligand-1，PD-L1）和PD-L2与PD-1结合可负性调节免疫反应，但PD-1/PD-L1信号通路调节免疫耐受的能力更为强大，其功能障碍在MS/EAE的发病中起到关键作用。可溶性PD-L1（solublePD-L1，sPD-L1）具有诱导DCs免疫耐受的潜能，或可成为MS/EAE免疫调节的新方法。<br>　　目的：<br>　　本研究旨在明确sPD-L1对EAE的治疗作用，评估sPD-L1调控DCs免疫耐受的能力，并进一步探索sPD-L1发挥免疫调控作用的具体机制。以期为MS的治疗提供新策略。<br>　　方法：<br>　　（1）将含有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55肽段、灭活结核分支杆菌H37Ra和完全弗氏佐剂（FCA）的混合乳液注射于C57BL/6J雌性小鼠背部皮下，并于免疫当天及间隔48h后腹腔注射百日咳毒素（PTX），成功建立EAE模型。出现首发症状时，sPD-L1组小鼠腹腔注射sPD-L1，对照组小鼠给予等体积PBS腹腔注射，均连续给药5天，进行体重及神经功能评分直至高峰期，高峰期处死小鼠取材进行相关检测：<br>　　①取小鼠眼球血分离血清，流式微球分析技术（cytometricbeadarray，CBA）检测三组小鼠血清中细胞因子（IL-10、IL-6、IL-12p70、TNF和IFN-γ）及趋化因子CCL2的水平；<br>　　②取小鼠脊髓制作石蜡切片，进行H＆E染色和LFB髓鞘染色；<br>　　③应用免疫荧光染色DCs（CD11c），评估脊髓内DCs的浸润情况；<br>　　④获取小鼠脾脏细胞，应用流式细胞术（flowcytometry，FCM）评估各组小鼠脾脏DCs的比例及其表面MHC-Ⅱ、CD80、CD83、树突状细胞相关C型凝集素1（dendritic-cell-associatedC-typelectin1，Dectin-1）、PD-1、PD-L1和趋化因子受体CCR7的表达情况；<br>　　⑤体外实验验证sPD-L1对骨髓来源树突状细胞（bonemarrow-deriveddendriticcells，BMDCs）表型和细胞因子分泌的影响；<br>　　⑥磁珠分选法获得小鼠脾脏DCs，pHrodoTMGreen酵母聚糖细胞吞噬实验检测DCs的吞噬功能，Transwell小室法检测DCs的迁移能力。<br>　　（2）磁珠分选法获取小鼠脾脏DCs，应用TMT标记定量蛋白组学测序技术对EAE模型组及sPD-L1治疗组小鼠脾脏DCs进行定量蛋白组学分析，筛选出潜在的关键调控蛋白，并应用Westernblot分析和原子力显微镜检测等进行验证。<br>　　结果：<br>　　（1）神经功能评分和体重：sPD-L1治疗组小鼠神经功能评分显著降低，高峰期时EAE模型组小鼠评分以中位数（四分位数间距）表示为3.0（1.5）分，sPD-L1治疗组小鼠评分为1.0（0）分，差异具有统计学意义（P＜0.0001）；sPD-L1可有效改善Day13以后EAE小鼠体重下降情况，高峰期时，sPD-L1治疗组小鼠体重高于EAE模型组，且差异具有统计学意义（19.93±1.14vs.17.74±1.75，P=0.003＜0.01）。<br>　　（2）血清细胞因子、脊髓病理、DCs表型和功能等：<br>　　①血清细胞因子：EAE模型组小鼠血清中TNF的水平明显高于正常对照组（33.80±13.68vs.10.58±4.11，P＜0.0001），而sPD-L1治疗组较EAE模型组明显下调（23.88±7.12vs.33.80±13.68，P=0.017＜0.05）。<br>　　②脊髓H＆E染色：正常对照组小鼠脊髓未见炎性细胞浸润；EAE模型组小鼠颈段、胸段、腰段脊髓均可见明显炎性细胞浸润，呈现特征性的血管“袖套”样改变；与EAE模型组相比，sPD-L1治疗组小鼠颈段、胸段、腰段脊髓的炎性细胞浸润均明显减少，“袖套”样改变明显减轻。<br>　　③脊髓LFB髓鞘染色：正常对照组小鼠脊髓LFB染色未见明显异常；EAE模型组小鼠颈段、胸段、腰段脊髓白质区均可见较多空泡化髓鞘脱失改变，甚至出现大片区域未着色；与EAE模型组相比，sPD-L1治疗组小鼠脊髓白质区空泡样改变明显减少、范围缩小，脱髓鞘程度显著减轻。<br>　　④脊髓免疫荧光染色DCs：EAE模型组小鼠脊髓中的DCs浸润明显增多，以脊膜下白质及前/后正中沟两侧区域为著，与炎性细胞浸润及髓鞘脱失区域相一致；与EAE模型组相比，sPD-L1治疗组小鼠脊髓中的DCs浸润明显减少。<br>　　⑤脾脏DCs及BMDCs表型：EAE模型组小鼠脾脏中DCs的比例较正常对照组显著升高，且DCs表面MHC-Ⅱ及CD83的表达显著上调，sPD-L1治疗组小鼠脾脏中DCs的比例较EAE模型组明显增加，但DCs表面CD83的表达显著下降，CD80的表达亦有下降的趋势，MHC-Ⅱ的表达无统计学差异；体外实验中，LPS刺激后，正常小鼠和EAE小鼠来源的BMDCs表面MHC-Ⅱ和CD80、CD83的表达均显著上调，在LPS刺激后24h给予sPD-L1，可显著下调CD80、CD83的表达，此外，对于EAE小鼠来源的BMDCs，MHC-Ⅱ的表达亦显著下调；在LPS刺激之前24h给予sPD-L1，MHC-Ⅱ和共刺激分子表达与LPS组相比均无统计学差异。EAE模型组小鼠脾脏DCs表面PD-1、PD-L1的表达均显著上调，sPD-L1治疗组DCs表面PD-1、PD-L1的表达较EAE模型组下调，仍高于正常对照组；体外实验中，同样观察到BMDCs表面PD-L1的表达变化，而对PD-1表达的影响较小。体内及体外实验均证实，sPD-L1可抑制CCR7的表达。<br>　　⑥BMDCs细胞因子的分泌水平：LPS刺激后，正常小鼠和EAE小鼠来源的BMDCs培养上清中，促炎性细胞因子IL-6、IL-12p70和TNF及趋化因子CCL2的分泌水平均显著升高，抗炎性细胞因子IL-10的分泌水平显著下降，IFN-γ的分泌水平没有明显差异。正常小鼠来源的BMDCs培养上清中，LPS刺激后24h给予sPD-L1可使IL-6、IL-12p70、TNF及CCL2的水平显著下调，IL-10的水平显著上调；而在LPS刺激之前24h给予sPD-L1，仅IL-6和IL-10的水平受到显著影响。EAE小鼠来源的BMDCs培养上清中，LPS刺激之前或之后24h给予sPD-L1，仅能使IL-10的水平显著上调。<br>　　⑦脾脏DCs吞噬和迁移功能：与正常对照组相比，EAE小鼠DCs的吞噬功能明显增强，且sPD-L1治疗组DCs的吞噬功能较EAE模型组增强；与正常对照组相比，EAE模型组小鼠DCs的迁移能力明显提高，sPD-L1治疗组DCs的迁移能力较EAE模型组明显降低。<br>　　（3）差异蛋白表达分析：与EAE模型组相比，sPD-L1治疗组小鼠脾脏DCs中，共有21个蛋白表达显著上调，11个蛋白表达显著下调，其功能多与信号转导机制、细胞骨架、翻译后修饰及辅酶的转运和代谢相关，其中显著上调的蛋白包括血影蛋白（spectrin）、β-内收蛋白（β-adducin）、锚蛋白、蛋白4.2等，与细胞骨架的重排密切相关，下调蛋白与多种炎性细胞的趋化、迁移等相关，如CCR7、趋化因子样受体1等。<br>　　（4）差异蛋白表达验证：与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脾脏DCs中βⅡ-spectrin的表达显著下调，而给予sPD-L1治疗可显著上调其表达；sPD-L1治疗可显著上调脾脏DCs中β-adducin的表达，同时，p-β-adducin的表达水平亦升高；sPD-L1治疗可显著上调EAE小鼠DCs中细胞外调节蛋白激酶1和2（extracellularregulatedproteinkinase1/2，ERK1/2）的磷酸化水平。<br>　　（5）BMDCs的力学特征分析：正常小鼠和EAE小鼠来源的BMDCs，与PBS处理相比，经LPS刺激成熟后，形成大量的丝状伪足，其细胞高度增大、表面粗糙度增加、粘附力减弱、杨氏模量减小；sPD-L1治疗组小鼠来源的BMDCs，与PBS处理相比，经LPS刺激后，仅形成少量的伪足，其表面粗糙度增加、粘附力减弱，而细胞高度和杨氏模量无显著变化。与EAE小鼠来源的BMDCs相比，sPD-L1治疗组小鼠来源的BMDCs伪足数量较少，其细胞高度较高，粘附力较强，差异均具有统计学意义，且表面粗糙度有下降的趋势，而杨氏模量无显著差异。<br>　　结论：<br>　　（1）sPD-L1可显著降低EAE小鼠的神经功能评分，有效改善EAE小鼠高峰期体重下降情况；显著减少EAE小鼠脊髓中的炎性细胞浸润，明显减轻其脱髓鞘程度。<br>　　（2）sPD-L1可通过不同程度地下调DCs表面MHC-Ⅱ及共刺激分子的表达，抑制其促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，促进抗炎性细胞因子的分泌，同时促进脾脏DCs的吞噬功能，调控DCs免疫耐受。<br>　　（3）sPD-L1可下调DCs表面CCR7的表达，抑制脾脏DCs的趋化迁移功能，显著减少EAE小鼠脊髓中的DCs浸润。<br>　　（4）sPD-L1可显著上调DCs中细胞骨架蛋白βⅡ-spectrin、β-adducin的表达，并促进ERK1/2的磷酸化。<br>　　（5）sPD-L1可调节BMDCs细胞力学特性：BMDCs成熟后，形成大量丝状伪足，其细胞高度增大、表面粗糙度增加、粘附力减弱、杨氏模量减小，其吞噬和抗原提呈功能及迁移能力增强；sPD-L1治疗后，BMDCs伪足数量较少，受外界刺激时的形变过程受到抑制，细胞高度增加，且粘附力增强，促进其吞噬功能，同时抑制其迁移能力。<br>　　综上所述，sPD-L1可通过调节DCs细胞骨架重排，影响其形态结构及力学特性，调控DCs吞噬功能、抗原提呈功能，调节其免疫表型和细胞因子分泌，诱导DCs免疫耐受，并负性调节DCs的趋化迁移功能，从而负性调节EAE小鼠免疫反应。