摘要背景:<br> 多发性硬化(multiplesclerosis,MS)是以CNS白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。目前已批准上市的DMT药物疗效有限,也可能导致恶性肿瘤及机会性感染等的发生。因此,积极探索新的免疫调节方法具有重要的科学价值。<br> 树突状细胞(dendriticcells,DCs)是体内最重要的专职抗原呈递细胞,在免疫耐受的构建和维持中发挥关键作用,与MS的发生和发展密切相关。体外诱导耐受性DCs回输治疗能够明显改善EAE,但因其流程复杂、费用高昂,且回输治疗可能出现严重的不良反应,限制了其临床转化。<br> 程序性死亡受体-1(programmedcelldeath1,PD-1)是一种免疫抑制性受体,广泛表达于T、B细胞及DCs等各类免疫细胞表面,程序性死亡受体-配体1(programmedcelldeathligand-1,PD-L1)和PD-L2与PD-1结合可负性调节免疫反应,但PD-1/PD-L1信号通路调节免疫耐受的能力更为强大,其功能障碍在MS/EAE的发病中起到关键作用。可溶性PD-L1(solublePD-L1,sPD-L1)具有诱导DCs免疫耐受的潜能,或可成为MS/EAE免疫调节的新方法。<br> 目的:<br> 本研究旨在明确sPD-L1对EAE的治疗作用,评估sPD-L1调控DCs免疫耐受的能力,并进一步探索sPD-L1发挥免疫调控作用的具体机制。以期为MS的治疗提供新策略。<br> 方法:<br> (1)将含有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽段、灭活结核分支杆菌H37Ra和完全弗氏佐剂(FCA)的混合乳液注射于C57BL/6J雌性小鼠背部皮下,并于免疫当天及间隔48h后腹腔注射百日咳毒素(PTX),成功建立EAE模型。出现首发症状时,sPD-L1组小鼠腹腔注射sPD-L1,对照组小鼠给予等体积PBS腹腔注射,均连续给药5天,进行体重及神经功能评分直至高峰期,高峰期处死小鼠取材进行相关检测:<br> ①取小鼠眼球血分离血清,流式微球分析技术(cytometricbeadarray,CBA)检测三组小鼠血清中细胞因子(IL-10、IL-6、IL-12p70、TNF和IFN-γ)及趋化因子CCL2的水平;<br> ②取小鼠脊髓制作石蜡切片,进行H&E染色和LFB髓鞘染色;<br> ③应用免疫荧光染色DCs(CD11c),评估脊髓内DCs的浸润情况;<br> ④获取小鼠脾脏细胞,应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)评估各组小鼠脾脏DCs的比例及其表面MHC-Ⅱ、CD80、CD83、树突状细胞相关C型凝集素1(dendritic-cell-associatedC-typelectin1,Dectin-1)、PD-1、PD-L1和趋化因子受体CCR7的表达情况;<br> ⑤体外实验验证sPD-L1对骨髓来源树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BMDCs)表型和细胞因子分泌的影响;<br> ⑥磁珠分选法获得小鼠脾脏DCs,pHrodoTMGreen酵母聚糖细胞吞噬实验检测DCs的吞噬功能,Transwell小室法检测DCs的迁移能力。<br> (2)磁珠分选法获取小鼠脾脏DCs,应用TMT标记定量蛋白组学测序技术对EAE模型组及sPD-L1治疗组小鼠脾脏DCs进行定量蛋白组学分析,筛选出潜在的关键调控蛋白,并应用Westernblot分析和原子力显微镜检测等进行验证。<br> 结果:<br> (1)神经功能评分和体重:sPD-L1治疗组小鼠神经功能评分显著降低,高峰期时EAE模型组小鼠评分以中位数(四分位数间距)表示为3.0(1.5)分,sPD-L1治疗组小鼠评分为1.0(0)分,差异具有统计学意义(P<0.0001);sPD-L1可有效改善Day13以后EAE小鼠体重下降情况,高峰期时,sPD-L1治疗组小鼠体重高于EAE模型组,且差异具有统计学意义(19.93±1.14vs.17.74±1.75,P=0.003<0.01)。<br> (2)血清细胞因子、脊髓病理、DCs表型和功能等:<br> ①血清细胞因子:EAE模型组小鼠血清中TNF的水平明显高于正常对照组(33.80±13.68vs.10.58±4.11,P<0.0001),而sPD-L1治疗组较EAE模型组明显下调(23.88±7.12vs.33.80±13.68,P=0.017<0.05)。<br> ②脊髓H&E染色:正常对照组小鼠脊髓未见炎性细胞浸润;EAE模型组小鼠颈段、胸段、腰段脊髓均可见明显炎性细胞浸润,呈现特征性的血管“袖套”样改变;与EAE模型组相比,sPD-L1治疗组小鼠颈段、胸段、腰段脊髓的炎性细胞浸润均明显减少,“袖套”样改变明显减轻。<br> ③脊髓LFB髓鞘染色:正常对照组小鼠脊髓LFB染色未见明显异常;EAE模型组小鼠颈段、胸段、腰段脊髓白质区均可见较多空泡化髓鞘脱失改变,甚至出现大片区域未着色;与EAE模型组相比,sPD-L1治疗组小鼠脊髓白质区空泡样改变明显减少、范围缩小,脱髓鞘程度显著减轻。<br> ④脊髓免疫荧光染色DCs:EAE模型组小鼠脊髓中的DCs浸润明显增多,以脊膜下白质及前/后正中沟两侧区域为著,与炎性细胞浸润及髓鞘脱失区域相一致;与EAE模型组相比,sPD-L1治疗组小鼠脊髓中的DCs浸润明显减少。<br> ⑤脾脏DCs及BMDCs表型:EAE模型组小鼠脾脏中DCs的比例较正常对照组显著升高,且DCs表面MHC-Ⅱ及CD83的表达显著上调,sPD-L1治疗组小鼠脾脏中DCs的比例较EAE模型组明显增加,但DCs表面CD83的表达显著下降,CD80的表达亦有下降的趋势,MHC-Ⅱ的表达无统计学差异;体外实验中,LPS刺激后,正常小鼠和EAE小鼠来源的BMDCs表面MHC-Ⅱ和CD80、CD83的表达均显著上调,在LPS刺激后24h给予sPD-L1,可显著下调CD80、CD83的表达,此外,对于EAE小鼠来源的BMDCs,MHC-Ⅱ的表达亦显著下调;在LPS刺激之前24h给予sPD-L1,MHC-Ⅱ和共刺激分子表达与LPS组相比均无统计学差异。EAE模型组小鼠脾脏DCs表面PD-1、PD-L1的表达均显著上调,sPD-L1治疗组DCs表面PD-1、PD-L1的表达较EAE模型组下调,仍高于正常对照组;体外实验中,同样观察到BMDCs表面PD-L1的表达变化,而对PD-1表达的影响较小。体内及体外实验均证实,sPD-L1可抑制CCR7的表达。<br> ⑥BMDCs细胞因子的分泌水平:LPS刺激后,正常小鼠和EAE小鼠来源的BMDCs培养上清中,促炎性细胞因子IL-6、IL-12p70和TNF及趋化因子CCL2的分泌水平均显著升高,抗炎性细胞因子IL-10的分泌水平显著下降,IFN-γ的分泌水平没有明显差异。正常小鼠来源的BMDCs培养上清中,LPS刺激后24h给予sPD-L1可使IL-6、IL-12p70、TNF及CCL2的水平显著下调,IL-10的水平显著上调;而在LPS刺激之前24h给予sPD-L1,仅IL-6和IL-10的水平受到显著影响。EAE小鼠来源的BMDCs培养上清中,LPS刺激之前或之后24h给予sPD-L1,仅能使IL-10的水平显著上调。<br> ⑦脾脏DCs吞噬和迁移功能:与正常对照组相比,EAE小鼠DCs的吞噬功能明显增强,且sPD-L1治疗组DCs的吞噬功能较EAE模型组增强;与正常对照组相比,EAE模型组小鼠DCs的迁移能力明显提高,sPD-L1治疗组DCs的迁移能力较EAE模型组明显降低。<br> (3)差异蛋白表达分析:与EAE模型组相比,sPD-L1治疗组小鼠脾脏DCs中,共有21个蛋白表达显著上调,11个蛋白表达显著下调,其功能多与信号转导机制、细胞骨架、翻译后修饰及辅酶的转运和代谢相关,其中显著上调的蛋白包括血影蛋白(spectrin)、β-内收蛋白(β-adducin)、锚蛋白、蛋白4.2等,与细胞骨架的重排密切相关,下调蛋白与多种炎性细胞的趋化、迁移等相关,如CCR7、趋化因子样受体1等。<br> (4)差异蛋白表达验证:与正常对照组相比,EAE模型组小鼠脾脏DCs中βⅡ-spectrin的表达显著下调,而给予sPD-L1治疗可显著上调其表达;sPD-L1治疗可显著上调脾脏DCs中β-adducin的表达,同时,p-β-adducin的表达水平亦升高;sPD-L1治疗可显著上调EAE小鼠DCs中细胞外调节蛋白激酶1和2(extracellularregulatedproteinkinase1/2,ERK1/2)的磷酸化水平。<br> (5)BMDCs的力学特征分析:正常小鼠和EAE小鼠来源的BMDCs,与PBS处理相比,经LPS刺激成熟后,形成大量的丝状伪足,其细胞高度增大、表面粗糙度增加、粘附力减弱、杨氏模量减小;sPD-L1治疗组小鼠来源的BMDCs,与PBS处理相比,经LPS刺激后,仅形成少量的伪足,其表面粗糙度增加、粘附力减弱,而细胞高度和杨氏模量无显著变化。与EAE小鼠来源的BMDCs相比,sPD-L1治疗组小鼠来源的BMDCs伪足数量较少,其细胞高度较高,粘附力较强,差异均具有统计学意义,且表面粗糙度有下降的趋势,而杨氏模量无显著差异。<br> 结论:<br> (1)sPD-L1可显著降低EAE小鼠的神经功能评分,有效改善EAE小鼠高峰期体重下降情况;显著减少EAE小鼠脊髓中的炎性细胞浸润,明显减轻其脱髓鞘程度。<br> (2)sPD-L1可通过不同程度地下调DCs表面MHC-Ⅱ及共刺激分子的表达,抑制其促炎性细胞因子和趋化因子的分泌,促进抗炎性细胞因子的分泌,同时促进脾脏DCs的吞噬功能,调控DCs免疫耐受。<br> (3)sPD-L1可下调DCs表面CCR7的表达,抑制脾脏DCs的趋化迁移功能,显著减少EAE小鼠脊髓中的DCs浸润。<br> (4)sPD-L1可显著上调DCs中细胞骨架蛋白βⅡ-spectrin、β-adducin的表达,并促进ERK1/2的磷酸化。<br> (5)sPD-L1可调节BMDCs细胞力学特性:BMDCs成熟后,形成大量丝状伪足,其细胞高度增大、表面粗糙度增加、粘附力减弱、杨氏模量减小,其吞噬和抗原提呈功能及迁移能力增强;sPD-L1治疗后,BMDCs伪足数量较少,受外界刺激时的形变过程受到抑制,细胞高度增加,且粘附力增强,促进其吞噬功能,同时抑制其迁移能力。<br> 综上所述,sPD-L1可通过调节DCs细胞骨架重排,影响其形态结构及力学特性,调控DCs吞噬功能、抗原提呈功能,调节其免疫表型和细胞因子分泌,诱导DCs免疫耐受,并负性调节DCs的趋化迁移功能,从而负性调节EAE小鼠免疫反应。
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