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摘要十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis），简称贾第虫（Giardia），是一种重要的人兽共患原虫，常引起腹泻。贾第虫结构简单，并呈现“永生化”，是研究生物起源和基因调控的理想“模式生物”。有研究发现贾第虫体内含有贾第虫病毒（Giardiavirus, GLV），并在1990年被国际病毒分类学委员会正式命名为真菌病毒科（Mycoviridae）、贾第病毒属（Giardivirus genus）、贾第虫病毒（Giardivirus），并且有研究发现GLV可以抑制贾第虫的生长。GLV由双链RNA（Double strand RNA, dsRNA）和衣壳蛋白组成，RNA 依赖 RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp）负责RNA病毒的复制和转录，需要和其他病毒或其宿主因子协同调控，目前对RdRp的调控蛋白研究较少，本课题组前期已经通过酵母双杂交技术筛选出伴侣蛋白J为贾第虫病毒RdRp的互作蛋白之一，但是RdRp在执行功能时可能需要多种蛋白共同调控，因此，本研究拟通过pull-down联合质谱技术筛选贾第虫病毒RdRp的互作蛋白，通过双分子荧光互补试验（Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC）、免疫共沉淀（co-inmunoprecipitation, Co-IP）和 Duolink?邻位连接检测方法验证其相互作用，然后探究RdRp互作蛋白的功能，丰富贾第虫病毒RdRp的调控网络，为下一步深入研究贾第虫与贾第虫病毒之间的关系提供理论依据，也可为高等动物的dsRNA病毒的研究提供了参考。<br>　　贾第虫病毒RdRp互作蛋白的筛选：构建真核诱饵质粒pcDNA3.1-Flag-RdRp，转染至 HEK-293T 细胞中后进行培养，裂解、收取细胞蛋白后与全虫蛋白在Anti-DYKDDDDK Magarose Beads中进行孵育结合，再进行LC-MS/MS质谱检测，初步筛选出可能与RdRp蛋白存在互作关系11种虫体蛋白，如Ribosomal protein S17蛋白、Kinesin-like protein和Rab2A蛋白等，通过质谱结果中蛋白评分发现Rab2A得分最高，因此选用Rab2A进行下一步验证。<br>　　贾第虫病毒 RdRp蛋白与 Rab2A蛋白相互作用验证：首先构建双分子荧光互补重组质粒 JUN-RdRp 和 FOS-Rab2A ，将两种无内毒素质粒共转染HEK-293T 细胞中，通过观察绿光荧光确定互作关系。然后构建pCDNA3.1-HA-Rab2A 和 pcDNA3.1-His-RdRp 真核表达质粒并共转染至HEK-293T细胞，通过Co-IP试验确定互作关系。最后制备鼠源Rab2A及兔源RdRp多克隆抗体，通过Duolink?邻位连接检测RdRp蛋白与Rab2A蛋白在贾第虫体内的相互作用和共定位。结果显示双分子荧光互补试验发现 RdRp 与Rab2A可在共转染的细胞中观察到绿光荧光，表明二者在细胞中存在互作关系，免疫共沉淀试验也验证了RdRp与Rab2A存在互作关系。 Duolink?邻位连接试验发现RdRp与Rab2A共定位于贾第虫滋养体的胞质中，说明二者之间存在相互作用。<br>　　贾第虫 Rab2A 蛋白功能的初步研究：构建贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶重组质粒pC631-HAM-Rab2A和对照组pC631-noHAM-Rab2A，进行体外切割试验。再将含有锤头状核酶的重组质粒进行转录，电转至贾第虫滋养体内，利用Real-Time PCR测定转录水平。结果表明锤头状核酶的体外切割效率可达84.79%，电转至贾第虫体内后发现，pC631-pac-Ham-Rab2A组中Rab2A的转录子含量为 31.9%，贾第虫病毒衣壳蛋白的转录子含量为 37.3%。试验结果表明Rab2A表达量的降低能抑制贾第虫病毒的转录水平，初步表明Rab2A蛋白对贾第虫病毒呈现正向调节关系。<br>　　综上所述，本研究首先通过pull-down联合质谱技术成功筛选了11种可能与贾第虫病毒RdRp存在互作关系蛋白，通过BiFC、Co-IP和Duolink?邻位连接检测成功验证了RdRp与Rab2A存在互作关系，最后利用贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶抑制Rab2A在贾第虫中的表达，试验结果表明Rab2A的表达量降低可减少贾第虫病毒基因的拷贝数，初步发现Rab2A蛋白对贾第虫病毒呈现正向调控作用，可为深入研究贾第虫Rab2A蛋白的功能提供基础。