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摘要在哺乳动物胚胎发育过程中，睾丸通常从泌尿生殖嵴经腹腔下降到体外阴囊中，阴囊通过热交换和热清除作用，使睾丸温度比核心体温低2-4℃，从而更有利于实现睾丸正常功能。如果睾丸在发育过程中未能下降到阴囊而是保留在腹腔中，则称之为隐睾症。隐睾症因睾丸长期留在腹腔内，受体内“高温”影响，容易造成雄性不育及睾丸癌等一系列风险。然而，一些哺乳动物在保持健康生殖的同时进化出了腹腔型睾丸，即健康“隐睾”。为了探究腹腔型睾丸哺乳动物“隐睾”及维持健康生殖的分子机制，我们通过基因编辑技术和功能分析探讨了睾丸下降相关基因RXFP2对于腹腔型睾丸哺乳动物“隐睾”的影响；通过比较基因组学、进化基因组学和功能实验探讨了精子发生相关基因的分子进化、功能进化及其对腹腔型睾丸哺乳动物维持健康生殖的影响。<br>　　松弛素家族肽受体2（RelaxinFamilyPeptideReceptor2,RXFP2），是编码G蛋白偶联受体（GPCR）家族成员，其在胚胎和出生后的引带以及成年睾丸生精细胞中表达。胰岛素样因子3（InsulinLike3,INSL3）与引带上受体RXFP2结合，激活G蛋白，上调细胞膜表面腺苷酸环化酶活性，增加细胞内cAMP浓度，进而促进引带组织的细胞分化，参与睾丸下降过程。INSL3或RXFP2基因的缺失将导致隐睾症的发生，这些基因的一系列突变也会造成睾丸下降异常。另外，有研究报道，RXPF2在一些睾丸不下降的非洲兽哺乳动物发生了丢失。鲸类作为次生性水生哺乳动物，为了适应水生生活，减少能量损失，其身体呈流线型，睾丸发生了不完全下降，终身停留在了腹腔内，但却具有正常的生殖功能。通过比较鲸类（腹腔型睾丸哺乳动物）与其亲缘关系近的偶蹄类（阴囊型睾丸动物）RXFP2蛋白序列，发现鲸类存在一些特异性氨基酸（I72L、N19D、P377S和V617A），这些特异性氨基酸均位于RXFP2重要功能域。此外，鲸类RXFP2特异氨基酸变异对蛋白质性质和功能潜在影响的评估的结果显示，这些特异性氨基酸可能对RXFP2蛋白质理化性质和功能等产生影响。因此，我们利用CRISPR/Cas9技术将瓶鼻海豚的RXFP2基因敲入小鼠，成功构建表达瓶鼻海豚RXFP2KI小鼠模型，欲探讨鲸类RXFP2对其睾丸不完全下降的影响。结果显示瓶鼻海豚RXFP2KI小鼠并未出现隐睾表型，睾丸大小和体重与野生型小鼠相当，组织切片也未发现明显异常，提示鲸类RXFP2可能不足以引起鲸类睾丸不完全。<br>　　另外，刺猬作为睾丸不完全下降的动物，也是研究腹腔型睾丸哺乳动物“隐睾”机制合适的动物模型，并且刺猬与鲸类相比，具有容易饲养和取得活体样本等优点。首先，我们从解剖学上证实刺猬（远东刺猬，Erinaceusamurensis）是腹腔型睾丸哺乳动物，其次，我们鉴定出刺猬RXFP2一个剪接变体，即缺少第11外显子的剪接变体（RXFP2-Del11），并且第11外显子位于富含亮氨酸重复（LRR）结构域，LRR内形成β折叠的氨基酸残基可与配体INSL3中特定B链的氨基酸残基相互作用，从而激发下游信号通路。接着，蛋白质定量分析表明，RXFP2-Del11转运到细胞膜上的蛋白比完整RXFP2少。放射性配体与受体结合亲和力分析结果显示，INSL3与RXFP2-Del11结合的亲和力比与RXFP2结合亲和力相对较弱，并且检测下游cAMP浓度时发现，INSL3与RXFP2-Del11结合后，下游cAMP浓度也相对较低。因此，刺猬RXFP2-Del11可能调控RXFP2细胞表面表达及功能活性，从而影响睾丸下降过程，导致其睾丸不完全下降。<br>　　为了探讨腹腔型睾丸哺乳动物维持健康生殖的分子机制，我们选取了劳亚兽代表性物种，对精子发生相关的泛素蛋白酶系统基因进行了比较基因组学和进化生物学分析。泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-ProteasomeSystem,UPS)是一种蛋白水解系统，负责调节细胞内蛋白水平与功能。UPS组成成分包括泛素、泛素启动酶、蛋白酶体和去泛素化蛋白酶。泛素启动酶包括泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3），负责活化泛素并将其结合到待降解的底物蛋白上，即泛素化。蛋白酶体可识别并降解已泛素化的靶蛋白。去泛素化蛋白酶则负责将泛素链从靶蛋白解离出来，再循环到胞质中。UPS在细胞周期进程、细胞凋亡及机体生长发育等过程发挥重要作用。此外，UPS还参与调控精子发生过程中的各种蛋白质降解，对精子发生发挥巨大作用。与精子发生相关的UPS基因的功能也被不断的报道。我们的分析结果发现，腹腔型睾丸劳亚兽UPS基因受到更强的正选择和快速进化，且这些基因在精子形成中起关键作用。如UCHL3作为一种去泛素化酶，参与调控生殖细胞凋亡和精母细胞向精子细胞的分化，其在腹腔型睾丸物种（鲸类）上检测到正选择信号，而且潜在的正选择位点位于UCHL3酶的活性中心域，提示这些物种可能通过加强对精子细胞凋亡的抑制，控制精子细胞损失来应对“隐睾”损伤。此外，我们还在具有相似腹腔型睾丸的远亲物种之间发现了潜在的趋同氨基酸，在不同腹腔型睾丸类群中存在各自独特的氨基酸替换，提示具有腹腔睾丸的物种之间可能存在趋同进化，不同腹腔型睾丸类群可能经历了各自独特进化。<br>　　为了验证腹腔型睾丸哺乳动物正选择基因和具趋同氨基酸或特异性氨基酸的基因功能是否发生了适应性改变，我们对正选择基因SPATA6进行了热稳定实验，对具特异性氨基酸的RNF8进行了对底物泛素化能力检测。SPATA6是组成精子小头和小结节的结构蛋白，在精子发生后期通过连接片段参与精子的发育。热稳定实验结果显示腹腔型睾丸物种（白鱀豚、瓶鼻海豚和黑狐蝠）的SPATA6蛋白在高温下的稳定性高于阴囊型睾丸物种（牛、羊驼和布氏鼠耳蝠），提示腹腔型睾丸哺乳动物精子发生相关结构蛋白可能进化出更高的热稳定性，以适应腹腔内较高的温度环境，维持正常的精子发生。RNF8作为E3连接酶，通过泛素化组蛋白参与精子细胞核小体重塑。我们在腹腔型睾丸劳亚兽哺乳动物中鉴定出RNF8V437I潜在的特异性氨基酸或趋同氨基酸，并由劳亚兽之外的哺乳动物证实，即腹腔型睾丸哺乳动物RNF8第437氨基酸多为异亮氨酸（I），阴囊型睾丸动物则多为缬氨酸（V），并且特异性氨基酸位于其RING结构域。细胞水平泛素化实验显示，瓶鼻海豚RNF8（437I）泛素化组蛋白（H2A）能力强于突变型瓶鼻海豚RNF8（437V），提示腹腔型睾丸动物RNF8可能在功能上发生了适应性进化，即进化出具更强的泛素化能力。因此，在“隐睾”损伤下,可能通过增强组蛋白去除以维持精子的形成。<br>　　综上，本研究运用生物信息学技术和功能实验，探讨了腹腔型睾丸哺乳动物“隐睾”的可能原因，以及为了维持健康生殖腹腔型睾丸哺乳动物精子发生相关基因在分子和功能上的适应性改变，为隐睾症患者的诊断和治疗提供了理论参考。