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摘要研究背景及目的：非酒精性脂肪肝病(Non‐alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是世界上最常见的慢性肝病之一，随着NAFLD的发病率不断上升，未来几十年内NAFLD将对全球的公共健康与卫生造成巨大负担。L-茶氨酸是一种主要存在于绿茶内的游离氨基酸，占茶叶干重的1%-2%。L-茶氨酸具有保护肝脏、抗氧化、抗炎和抑制肥胖等多种生物学功能。关于L-茶氨酸对脂代谢的影响虽然已有报道，但其具体机制仍不清楚。本研究旨在通过体内外细胞和动物实验，探究L-茶氨酸是否通过调节脂肪酸（Freefattyacid,FFA)）代谢抑制NAFLD的发生发展及其分子机制。<br>　　研究方法：体外细胞实验以HepG2和AML12细胞系为研究对象，首先通过CCK8法检测L-茶氨酸对两种细胞系的毒副作用，以确定后续给药浓度。同时用500μM油酸（oleicacid,OA）刺激HepG2和AML12细胞24h建立NAFLD体外模型。采用油红O染色检测两种肝细胞内的脂质沉积情况，并使用生化试剂盒检测肝细胞内的甘油三酯（triglyceride,TG）含量。Westernblot和免疫组织化学检测L-茶氨酸对与脂肪酸（FFA）代谢相关蛋白表达的影响，免疫荧光检测SREBP-1c的入核。体内实验本研究首先采用灌胃给药方式，给与正常饲喂（Normalcontrolgroup,NCD）处理的C57BL/6J小鼠不同浓度的L-茶氨酸16周，每日一次。每周定时检测小鼠体重，实验终点检测血脂及肝功能相关指标：ALT、AST、TG、TC、LDL-C和HDL-C，明确L-茶氨酸对小鼠的毒副作用及最佳给药浓度。在明确L-茶氨酸对C57BL/6J小鼠的毒副作用及最佳给药浓度的基础上，利用高脂饮食（Highfatdiet,HFD）喂养C57BL/6J小鼠16周，建立NAFLD体内模型，L-茶氨酸药物处理组，在HFD喂养的同时每天一次灌胃给药300mg/kgL-茶氨酸，动物实验期间，每周定时检测小鼠体重，实验终点，摘眼球取血并分离血清检测血脂及肝功能指标：ALT、AST、TG、TC、LDL-C和HDL-C，并解剖分离各组实验动物肝脏，部分冻存后用于后续qRT-PCR及Westernblot检测相关分子的mRNA及蛋白表达水平，剩余部分4%多聚甲醛固定后，常规石蜡或冷冻包埋，切片，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,Hamp;E）染色及油红O染色检测L-茶氨酸对NAFLD肝内脂质沉积的影响，免疫组织化学检测L-茶氨酸对与FFA代谢相关蛋白表达的影响。<br>　　结果：1.CCK8检测不同浓度的OA和L-茶氨酸对HepG2和AML12两种细胞系活力的影响，结果表明0-500μM浓度的OA和0-4mM浓度的L-茶氨酸对两个细胞系的细胞活力都没有显著影响，我们将采用500μMOA和0-4mML-茶氨酸用于后续实验。油红O的染色结果表明L-茶氨酸可以呈剂量依赖性地降低HepG2和AML12细胞中的TG含量。同时试剂盒检测不同处理组细胞内的TG含量，结果与上述一致。体外的研究结果表明L-茶氨酸呈剂量依赖性地抑制HepG2和AML12细胞内的TG含量和脂质沉积。<br>　　2.L-茶氨酸持续灌胃给药16周，对正常小鼠体重及血清生化指标ALT、AST、TG、TC和LDL-C均无显著影响，但呈现出降低血清中ALT、AST、和TG水平的趋势，并显著提高HDL-C的水平。说明L-茶氨酸无明显的毒副作用，可用于后续动物实验。<br>　　3.L-茶氨酸可以显著减少HFD诱导的小鼠体重增加，减小白色脂肪组织的体积，改善血清中与肝脏功能相关的指标ALT、AST，降低血清中TG、LDL-C水平，进而有效抑制HFD诱导产生的肝脏脂质沉积。<br>　　4.由于肝脏内的脂质沉积与FFA的代谢密切相关，因此我们首先探索L-茶氨酸抑制FFA合成的内在分子机制，我们首先在体外检测了L-茶氨酸对OA诱导的与FFA合成相关蛋白表达的影响。Westernblot检测结果表明L-茶氨酸在HepG2和AML12细胞内都显著抑制了与FFA合成相关蛋白ACC1、FASN和PPARγ的表达。进一步探究发现L-茶氨酸是通过mTOR-SREBP1c-ACC1/FASN信号通路抑制FFA的合成，从源头上减少肝脏内的脂质沉积。体内检测结果与体外一致。<br>　　5.NAFLD的脂质沉积除了与FFA合成代谢异常有关外，还与其β氧化有关。接着我们在体内外探究了L-茶氨酸对HFD诱导的与FFAβ氧化相关分子的基因及蛋白表达的影响。体内外检测结果表明L-茶氨酸显著促进了FFAβ氧化相关分子PPARα和CPT1A的mRNA和蛋白表达。表明L-茶氨酸通过促进PPARα和CPT1A的表达促进FFAβ氧化，加速FFA的清除，减少肝脏内的脂质沉积。<br>　　6.AMPK是调节细胞代谢的关键因子，调节脂质的合成和氧化。结果表明L-茶氨酸通过激活CaMKKβ而上调AMPK的表达。<br>　　结论：L-茶氨酸通过CaMKKβ-AMPK信号通路一方面抑制mTOR-SREBP1c-ACC1/FASN信号通路，抑制FFA的合成，从源头上减少肝内脂质的含量；另一方面又通过促进PPARα和CPT1A的表达促进FFAβ氧化，从而加快FFA的清除，减少了肝内的脂质沉积，抑制NAFLD的发生发展。