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摘要骨肉瘤作为最常见的骨组织恶性肿瘤，主要高发于儿童及青少年人群，具有早期全身转移的特征。据统计，发生转移的患者，5年生存率不足20%，治疗前未见转移的患者，治疗后5年存活率可达60%，但是最终会发生转移，导致长期存活率下降。骨肉瘤实体细胞通常具有染色体异倍体的特征，导致细胞产生异倍体的最主要原因是异常的细胞有丝分裂。近年来大量的研究表明，表观遗传调控几乎参与了所有肿瘤的发生和发展过程。本论文第一部分研究发现，敲除表观遗传调控分子Dot1L导致了骨肉瘤细胞染色体异倍体出现的比例明显增加，进一步研究发现Dot1L是通过其底物H3K79me抑制了动粒-微管错误连接的纠正，导致姐妹染色单体错误分离而产生异倍体。<br>　　骨肉瘤现行标准治疗方案是手术治疗结合非特异性化疗药物治疗，但面临着化疗药物有限，但易产生耐药性的临床问题，导致总体预后效果不理想。本论文第二部分选用了DNA损伤类药物顺铂，初步探索了Dot1L抑制剂与细胞顺铂耐药的关系，研究发现Dot1L抑制剂与顺铂的联合使用，有利于促进耐药细胞的凋亡。论文两个部分分别研究了Dot1L对骨肉瘤发生发展与化疗耐药的影响，这符合一个分子可能在多个生物学过程发挥作用的科学现象。<br>　　第一部分Dot1L参与骨肉瘤细胞有丝分裂调控的机制研究<br>　　骨肉瘤是最常见的恶性原发性骨肿瘤，面临着临床治疗靶向性不足的问题。表观遗传学及细胞有丝分裂相关研究可以为骨肉瘤精准治疗提供新的药物靶点。表观遗传调控分子Dot1L是唯一催化组蛋白H3第79位赖氨酸发生甲基化（H3K79me1/2/3）的甲基转移酶。Dot1L在骨肉瘤发生发展中的生物学功能和具体调控机制及Dot1L特异性抑制剂应用于骨肉瘤临床治疗的理论基础，尚未见相关报道，需要深入的探索。<br>　　我们发现骨肉瘤细胞系中，Dot1L发生有丝分裂期特异性磷酸化修饰，即随着细胞进入有丝分裂期，被CDK1/CyclinB磷酸化，而随着细胞出有丝分裂，逐渐发生去磷酸化，其底物H3K79的甲基化水平与Dot1L磷酸化水平正相关。利用siRNA和CRISPR/Cas9技术使Dot1L功能损失（lossoffunction），结合活细胞实时成像和免疫荧光实验，发现细胞有丝分裂期时间明显延长，染色体碎裂、桥连、微核等有丝分裂错误比例显著增高，提示Dot1L参与调控细胞有丝分裂进程。<br>　　进一步探索发现，Dot1L敲除的细胞在有丝分裂中期，着丝粒与微管正确连接的比例明显降低，姐妹着丝粒之间的张力减小，且细胞纠正着丝粒-微管错误连接的能力明显减弱。染色体乘客复合体（CPC）负责检查及纠正着丝粒-微管错误连接，激活纺锤体检查点（SAC）使细胞停滞在有丝分裂前中期，直到着丝粒-微管正确连接，姐妹着丝粒之间的张力均等，细胞进入后期。通过免疫荧光实验证实，Dot1L敲除后，CPC的核心成员AuroraB定位在着丝粒上的比例明显减少，其活性明显降低。根据文献报道，影响AuroraB着丝粒定位的主要有：Survivin-H3T3ph和Sgo1-H2AT120ph两条途径。通过观察着丝粒附近Surivin、H3T3磷酸化、Sgo1、H2AT120磷酸化等分子发现，敲除Dot1L不影响H2AT120磷酸化水平，而使H3T3磷酸化水平显著降低，进而通过Survivin-H3T3ph途径导致AuororaB着丝粒定位减少。有丝分裂期，直接调控H3T3磷酸化水平主要有蛋白激酶Haspin和磷酸酶PP1γ/Repo-man。通过观察Haspin和PP1γ/Repo-man的翻译后修饰水平与染色体定位，发现敲除Dot1L不影响蛋白激酶Haspin对H3T3ph的磷酸化过程，而是通过增加PP1γ的调节亚基Repo-man的染色体定位，促进其对H3T3ph的去磷酸化过程。免疫共沉淀实验发现，H3K79甲基化水平介导调控Repo-man与组蛋白的结合，影响H3T3磷酸化水平，进而影响CPC被招募到着丝粒上，调控细胞有丝分裂进程。<br>　　综上所述，本研究阐明Dot1L抑制Repo-man有丝分裂前中期的染色体定位，利于H3T3磷酸化水平升高，招募CPC核心成员AuroraB到着丝粒上，调控动粒-微管正确连接，确保姐妹染色单体正确分向两极与细胞基因组稳定传递。Dot1L调控细胞有丝分裂进程分子机制的揭示，为肿瘤的精准治疗提供了新的靶点，并为Dot1L特异性抑制剂应用于骨肉瘤临床治疗的提供了理论基础。<br>　　第二部分Dot1L对骨肉瘤细胞DNA损伤修复机制的初步探索<br>　　骨肉瘤是最常见的骨组织恶性肿瘤，现行的治疗手段是手术治疗结合新辅助化疗。目前，骨肉瘤化疗药物为大剂量甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂和异环磷酰胺等，存在靶向性不高且易产生耐药性等问题，影响骨肉瘤患者的生存率。骨肉瘤细胞发生化疗耐药的分子机制的深入研究，可为实现个体化精准治疗提供理论依据。<br>　　顺铂类化疗药物常通过诱导肿瘤细胞发生DNA损伤而发挥抑瘤作用，但细胞体内复杂的DNA损伤后修复机制可能是化疗耐药的原因之一。相关研究证明，细胞DNA损伤后修复过程受到组蛋白翻译后修饰调控。组蛋白H3的第79位赖氨酸甲基化水平受甲基转移酶Dot1L的调控，Dot1L对骨肉瘤细胞DNA损伤修复功能的调控和具体机制，及DOT1L特异性抑制剂应用于骨肉瘤化疗耐药的理论基础，均需要更加深入的探索。<br>　　为完成上诉科学问题，本研究首先构建了DNA损伤后修复模型，并初步探索了：Dot1L抑制剂是否导致骨肉瘤细胞DNA损伤的累积；Dot1L是否参与DNA损伤修复；Dot1L抑制剂与顺铂联合处理是否影响骨肉瘤细胞活力。通过免疫荧光、彗星实验，检测γ-H2AX、磷酸化的DNA-PKcs、53BP1等分子证明DNA损伤后修复模型构建成功，进一步实验发现，使用Dot1L抑制剂EPZ-5676加重了顺铂处理骨肉瘤细胞导致的DNA损伤，细胞活力明显降低，具体分子机制需要继续进一步探索。这可能为Dot1L特异性抑制剂应用于骨肉瘤化疗耐药提供实验依据。