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摘要研究目的:<br>　　三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）是一种侵袭性乳腺癌，没有雌激素受体（ Estrogen receptor ， ER ），孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的表达。它是一种高度转移的异质性疾病，占乳腺癌总病例的10-15%，与非TNBC病例相比，治疗后五年内预后较差，复发率高。TNBC肿瘤的诊断和亚型对于确定治疗方案并为每个 TNBC 个体建立个性化，有针对性的药物至关重要。CDK7 是细胞周期蛋白家族（Cyclin-dependent kinase，CDK）的重要成员之一，其参与调节多种生物过程，如细胞周期、基因转录和DNA修复。研究显示CDK7在TNBC中显著高表达，与TNBC临床预后显著相关，并形成肿瘤发生的驱动力，因此靶向CDK7可能成为治疗TNBC发生发展有效手段之一。本课题组前期合成并筛选了CDK7抑制剂THZ1的结构改造物——ZJC-11，发现其可能具有抗 TNBC 作用。因此本研究探究了ZJC-11药物代谢与动力学特征，阐述了ZJC-11对TNBC细胞周期、转录以及 DNA 修复的影响机制，提供了靶向 CDK7 可作为抗TNBC 的可行性证据，进一步为临床开发更多高效的 CDK7 抑制剂提供参考。<br>　　研究方法:<br>　　一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究<br>　　1. 通过MTT实验筛选15个THZ1结构改造化合物的抗TNBC细胞活性，得到化合物ZJC-11；<br>　　2．通过药代动力学研究ZJC-11的药代动力学特征，KM小鼠单次尾静脉给予10mg/kg ZJC-11和10mg/kg THZ1，在给药后5min、10min、15min、30min、1h、2h取眼眶静脉血，分离得到含药血浆，样品经前处理后采用HPLC/MS检测样品血药浓度，再用DAS 3.0软件计算主要药代动力学参数（如t1/2、AUC、CL等），并拟合药时曲线。<br>　　3. 通过 MTT 检测 ZJC-11 对 TNBC 细胞系（MDA-MB-231 和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞活力的影响；<br>　　4. 通过细胞克隆和明场下观察 ZJC-11 对 TNBC 细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞增殖和细胞形态的影响；<br>　　5. 通过流式细胞术和荧光检测 ZJC-11 对 TNBC 细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞死亡的诱导作用；<br>　　6. 通过流式细胞术检测 ZJC-11 对 TNBC 细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞周期和细胞活性的影响；<br>　　7．通过Western Blot检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）、ER/PR+细胞系（ZR-75-1）以及肿瘤组织中CDK7和RNAPⅡ的磷酸化蛋白水平的影响；<br>　　8. 通过建立 BALB/c 裸鼠体内 MDA-MB-231 细胞原位移植瘤模型，腹腔注射给予4mg/kg和8mg/kg ZJC-11，观察ZJC-11对裸鼠肿瘤生长及体重的影响；<br>　　9. 通过免疫组化检测ZJC-11对细胞增殖标志物Ki67的影响。<br>　　二、CDK7抑制剂ZJC-11抗TNBC的机制研究<br>　　1. 通过体外激酶活性实验检测ZJC-11对CDK2、CDK7以及CDK9的选择性抑制作用；<br>　　2. 通过分子对接模型验证ZJC-11与CDK7的结合作用；<br>　　3. 通过转录组学分析 ZJC-11 对 TNBC 细胞系（MDA-MB-231）基因转录的影响；<br>　　4. 通过Reactome富集分析探究ZJC-11诱导细胞衰老的作用。<br>　　研究结果:<br>　　一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究<br>　　1. 通过对15个化合物的抗TNBC活性筛选发现，ZJC-11能够抑制MDA-MB-231细胞活力，且IC50均高于其余化合物；<br>　　2. 药代动力学实验结果显示，与THZ1相比，ZJC-11的AUC、C0、Cmax明显较高，而Tmax较低，这表明ZJC-11在血浆中暴露量比THZ1大。相反，ZJC-11的Vd和CL更低，这表明了ZJC-11的清除率更高，并且其在体内的分布更窄。<br>　　3. MTT实验结果表明，相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1，ZJC-11分别处理TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468 48h和72h后能显著降低细胞活力，并且具有较好的时间依赖性和剂量依赖性；<br>　　4. 细胞克隆实验及明场观察细胞结果表明，相比ER/PR+乳腺癌细胞 ZR-75-1，ZJC-11 能显著改变 TNBC 细胞 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468细胞形态并明显抑制集落形成；<br>　　5. 流式细胞术和荧光检测结果表明，相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1，ZJC-11能显著诱导TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞死亡；<br>　　6. 流式细胞术检测结果表明，相比 ER/PR+乳腺癌细胞 ZR-75-1， ZJC-11能显著引起TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞周期G2/M期阻滞；<br>　　7. Western Blot实验结果表明，与ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1相比，ZJC-11能显著抑制TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468中RNAPⅡ 磷酸化蛋白的表达水平，而对 CDK7 的蛋白表达没有明显影响；<br>　　8. 裸鼠原位移植瘤实验结果表明，ZJC-11可以显著抑制肿瘤的生长，但对裸鼠体重无明显影响；<br>　　9. Western Blot实验结果表明，ZJC-11能够显著抑制体内RNAPⅡ磷酸化蛋白的表达水平，同样对CDK7的蛋白表达水平没有明显影响；<br>　　10. 免疫组化结果表明，ZJC-11能够抑制细胞增殖标志物Ki67的表达。<br>　　二、CDK7抑制剂ZJC-11抗TNBC的机制研究<br>　　1. 体外激酶活性检测结果显示 ZJC-11 对 CDK7 具有显著的选择性抑制作用；<br>　　2. 分子对接结果显示，ZJC-11与CDK7具有较强的结合能力；<br>　　3. 差异表达基因火山图结果表明，ZJC-11 能够广泛抑制 MDA-MB-231细胞中的基因转录水平，提示在差异表达基因中（Padjust＜0.01， FC＞2.0和FC＜0.5），显著上调基因889个，显著下调基因725个。<br>　　4. 通过Reactome富集分析显示，差异表达基因主要富集在基因转录、细胞周期以及DNA损伤修复。在Reactome Pathway中，有多条与细胞衰老相关的通路。<br>　　5. 通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色和PCR检测结果显示，ZJC-11能够诱导MDA-MB-231细胞衰老。<br>　　研究结论:<br>　　ZJC-11具有更好的溶解性，显著靶向抑制CDK7的表达，并通过抑制 RNAPⅡ 磷酸化水平阻滞细胞周期和基因转录进程，进一步诱导细胞衰老来发挥抗TNBC的作用。