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摘要背景：<br>　　骨髓间充质干细胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）已广泛用于基因治疗，组织工程，细胞替代治疗和再生医学，被认为是一种非常理想的种子细胞。BMSCs的成骨分化在转录和转录后水平上受一系列编码RNA和非编码RNA的调节。因此，进一步探索BMSCs的成骨分化调控机制有助于BMSCs在骨组织工程中的应用。目前，有关环状RNA在BMSCs成骨分化过程中的作用机制尚不明确。在本课题组前期的研究中已经通过实验验证了mmu_circ_009056通过miR-22-3p靶向调控BMP7从而介导MC3T3细胞系的成骨分化，实验中我们发现，干扰mmu_circ_009056使成骨标志物RUNX2的表达下降，而其作用机制尚不明确。因此，本次研究在前期研究基础上，以成骨标志物RUNX2为研究的目的基因，深入探索mmu_circ_009056在BMSCs成骨诱导分化过程中对RUNX2的调控机制。<br>　　目的：<br>　　在本实验研究中，通过细胞实验来检测mmu_circ_009056在BMSCs成骨诱导过程中的作用，并进一步探讨mmu_circ_009056在成骨向分化过程中通过介导miR-139-3p/Pax5调控RUNX2的作用机制。<br>　　材料和方法：<br>　　（1）配制成骨诱导液，体外诱导C57/BL小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨向分化，茜素红染色检测诱导液效果，qRT-PCR检测成骨相关转录因子RUNX2、OPN，以及mmu_circ_009056的表达。<br>　　（2）在功能实验中，设计小分子干扰RNA（siRNA），利用转染技术干扰mmu_circ_009056，通过茜素红染色、qRT-PCR以及Westernblot检测mmu_circ_009056对BMSCs成骨向分化的影响。<br>　　（3）对干扰mmu_circ_009056处理3d、7d的BMSCs样本进行miRNA测序以及mRNA测序。筛选出3d、7d共同表达下调的mRNA和共同表达上调的miRNA。通过文献查阅进行mRNA的筛选，通过qRT-PCR验证测序结果。通过RegRNA2.0和miRWalk2.0等网站预测mmu_circ_009056和筛选得到的mRNA可能靶向结合的miRNA，与miRNA测序结果取交集。通过qRT-PCR验证测序结果。RNAhybrid验证及预测结合的作用靶点。UCSC网站检测得到RUNX2启动子区域的序列，结合PROMO网站预测结合RUNX2启动子的转录因子。<br>　　（4）细胞转染技术构建miR-139-3p过表达与低表达BMSCs细胞模型，qRT-PCR实验检测miR-139-3pmimic和miR-139-3pinhibitor的干扰效率，并通过qRT-PCR、Westernblot检测Pax5以及RUNX2的表达。<br>　　（5）设计针对Pax5的siRNA，将si-Pax5转染进入BMSCs细胞，qRT-PCR实验确定si-Pax5的转染效率，通过qRT-PCR、WesternBlot检测RUNX2的表达水平。<br>　　（6）诱导C57/BL小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨向分化，qRT-PCR检测miR-139-3p及pax5的表达。<br>　　结果：<br>　　（1）qRT-PCR检测结果显示，BMSCs细胞成骨向诱导3d、7d，mmu_circ_009056的表达水平明显高于对照组。<br>　　（2）转染siRNA干扰mmu_circ_009056后可降低mmu_circ_009056的表达。14d茜素红染色实验显示干扰mmu_circ_009056的siRNA组较阴性对照组（NC）的钙结节显著降低，qRT-PCR和Westernblot结果显示RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达均降低，说明了mmu_circ_009056在BMSCs成骨分化过程中的起正向调节作用。<br>　　（3）对干扰mmu_circ_009056处理3d、7d的BMSCs样本的mRNA测序结果进行筛选，筛选出3d、7d样本有共同下调表达且与成骨相关的基因Pax5、Apod、Mx1、Ccl5。qRT-PCR结果显示，与阴性对照组相比，siRNA组中Pax5下调最显著，结果具有统计学意义，因此将Pax5作为研究对象。通过RegRNA2.0和miRWalk2.0等网站预测mmu_circ_009056和筛选得到的Pax5可能靶向结合的miRNA，与miRNA测序结果取交集得到miR-139-3p、miR-365-1-5p，qRT-PCR结果显示miR-139-3p表达上升更显著，因此将miR-139-3p作为研究对象。根据RNAhybrid可知miR-139-3p与mmu_circ_009056和Pax5均存在互补配对序列。<br>　　（4）通过生物信息学网站RNAhybrid预测出miR-139-3p与Pax5的3’UTR存在靶向结合关系。通过转染miR-139-3pinhibitor能够促进Pax5和RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达，而转染miR-139-3pmimic能够抑制Pax5和RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。qRT-PCR与WesternBlot实验显示miR-139-3pmimic能够负向调节靶基因Pax5以及RUNX2的表达。<br>　　（5）通过PROMO预测网站得出有2个在RUNX2的启动子上游2000bp区域与Pax5结合的位点结合。qRT-PCR与WesternBlot结果显示抑制Pax5表达能够抑制RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。<br>　　（6）与完全培养基组（PM）相比，在诱导组（OM）中miR-139-3p的表达下调，同时Pax5及RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达上调。<br>　　结论：<br>　　mmu_circ_009056正向调节BMSCs的成骨分化过程。mmu_circ_009056可能通过对miR-139-3p/Pax5表达的调控，调节RUNX2的表达从而调控BMSCs的成骨诱导反应。