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摘要DNA 甲基化是一种常见的表观遗传修饰，在多种生物学过程中发挥关键作用，如X染色体失活、基因表达、胚胎发育、基因组印记、癌症的发生发展等。胚胎干细胞是一类具有无限自我更新能力及分化潜能的多能干细胞，已有研究表明DNA甲基化与胚胎干细胞的多能性及分化能力密切相关。<br>　　亚硫酸氢盐测序是检测DNA甲基化的金标准。然而，在重亚硫酸盐转化过程中，DNA双链会打开并分离，数据分析难以明确同一条DNA来源的两条链的甲基化状态。为了分析细胞中DNA两条链甲基化的对称性，本研究参考已有文献建立了发卡－全基因组甲基化测序（Hairpin whole genome bisulfite sequencing， HPWGBS）体系，利用发卡接头将DNA的正负链连接在一起，测序得到来源于同一条DNA双链的两条链的甲基化状态。<br>　　本研究首先对亚硫酸氢盐转化的效率进行了检测，结果表明在亚硫酸氢盐浓度为 0.5×，BS 转化时间为 9 h 时，转化效率最高。本研究优化了发卡接头和测序接头的比例，使发卡接头的连接效率达到较高水平。扩增后的文库经过磁珠纯化和琼脂糖凝胶电泳分离，使得到的产物中发卡接头的连接效率达到90%以上。为了研究胚胎干细胞中DNA半甲基化的状态，分别使用超声打断和酶法打断获得的DNA进行HPWGBS建库，测序得到100G的数据。分析发现发卡接头的连接效率为91%，基因组比对效率为 78%以上。CpG 位点的总体覆盖为 95%，其中大于 70%的 CpG 测了 5 次以上，表明该体系比较完整地检测了基因组中的CpG位点。对双链的DNA甲基化水平进行分析，结果表明胚胎干细胞中的全甲基化水平为26.30%，正链甲基化水平为7.82%，负链的甲基化水平为7.74%。<br>　　在ESCs分化过程中，伴随着多能性基因和胚层分化相关基因的甲基化状态的调整。为了从单细胞水平明确ESCs分化过程中特定基因调控区域（主要为CpG岛）甲基化状态的变化模式，研究根据多能性基因（如Fut4、Prmt5、Vgll4）和三胚层标志基因（如Tubb3、Meis1、Pdgfra、Bmp4、Hand1、Gata6、Klf5、Sox17、Foxa2、Gsc、Cxcr4）的CpG岛序列设计了用于重亚硫酸盐-PCR的引物。收集ESCs拟胚体分化和原始态-始发态（NPT）分化过程中的样品，提取基因组DNA，进行重亚硫酸盐转化后用于 BS-PCR。每个样品的 PCR 产物等摩尔混合后进行酶法打断成 300 bp 左右的片段，连接测序接头进行文库构建，以同时检测同一样品中多个靶标区域的DNA甲基化状态。目前，本研究可以实现多对引物同时放入反应体系进行 BS PCR。<br>　　综上所述，本研究 1）建立并优化了HPWGBS 体系，并用于研究 ESCs 中DNA半甲基化的分布情况，2）解析了ESCs随机分化和NPT过程中多能性和分化相关基因CpG岛甲基化的转变模式。因此，为研究多种细胞、组织中DNA半甲基化的分布和功能提供了技术手段，为进一步理解ESCs多能性退出或者转变过程中的调控机制提供了参考。