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摘要目的：<br>　　多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是一种恶性浆细胞病，发病率已超过白血病高居血液系统肿瘤第二位。硼替佐米（Bortezomib，BTZ）是目前治疗MM的基石，但不可避免的出现原发及继发性耐药严重影响患者的预后及疗效。越来越多的研究指出高钙血症是MM发生发展、耐药性获得及预后不良的关键因素，但其发生的分子机制尚不清楚。本研究旨在探索钠钙交换蛋白1(Na+/Ca2+exchanger1,NCX1)干扰细胞钙稳态对MM发生发展及BTZ敏感性的影响及机制研究。<br>　　方法：<br>　　1.收集MM临床样本，利用免疫组化检测骨髓组织中NCX1的表达情况，分析NCX1表达与MM疾病分期、血钙水平、β2微球蛋白等临床特征的联系以及NCX1与骨髓CD138+细胞百分比的关系；Kaplan-Meier法分析NCX1表达水平对BTZ疗效和总体生存（Overallsurvival,OS）的影响。<br>　　2.WesternBlot技术检测MM细胞系（RPMI8226、U266、KMS-11、MM1S）中NCX1蛋白的表达情况，通过CCK8、集落形成实验及流式细胞仪检测敲低、过表达NCX1前后及加入NCX1抑制剂KB-R7943前后MM细胞增殖和细胞凋亡的变化。<br>　　3.通过CCK8及流式细胞仪检测加入KB-R7943或敲减NCX1前后加入BTZ后各组细胞间的增殖、凋亡及细胞周期的改变情况。<br>　　4.利用流式细胞仪检测NCX1在MM细胞上转运Ca2+的功能，观察KB-R7934、内钙螯合剂BAPTA-AM对细胞内钙稳态及对BTZ敏感性的影响。<br>　　5.通过WesternBlot技术、共聚焦显微镜及电镜检测NCX1/Ca2+对自噬相关蛋白（P62、ATG5、ATG7、LC3）、自噬小体及自噬流的影响；利用CCK8、集落形成实验及流式细胞仪验证自噬在高表达NCX1的MM细胞对BTZ的敏感性影响。<br>　　6.通过转录组测序来评估NCX1相关的信号通路。通过WesternBlot技术检测过表达及敲低NCX1对经典及非经典NFκB信号通路的影响；通过JASPAR序列分析预测NFκB2与NCX1启动子区域的结合位点，并通过荧光素酶实验证实NFκB2对NCX1转录活性的影响。<br>　　7.动物体内模型观察抑制NCX1的表达对MM小鼠模型肿瘤负荷和生存情况的影响，并验证其对BTZ疗效的影响。同时通过免疫组化检测NCX1、CD138、Ki67、ATG5及ATG7蛋白表达。<br>　　结果：<br>　　1.免疫组化结果显示：与缺铁性贫血相比，NCX1在MM骨髓组织中高表达；NCX1的蛋白表达水平与血清钙、β2微球蛋白及骨髓CD138+细胞百分比呈正相关，且NCX1表达与骨髓瘤ISS分期相关。Kaplan-Meier法分析结果显示具有NCX1低表达的MM患者具有更好的OS（24.6个月vs14.8个月）。<br>　　2.WesternBlot结果显示NCX1在骨髓瘤细胞系中均有表达。CCK8、集落形成试验及流式细胞仪的结果显示抑制NCX1能够抑制MM细胞增殖、集落形成，而促进细胞凋亡。<br>　　3.CCK8和流式细胞仪的结果显示抑制NCX1能够协同BTZ抑制MM细胞增殖，促进MM细胞凋亡；且NCX1的抑制能够增加BTZ诱导的G2/M期阻滞和S分裂间期缩短。<br>　　4.流式细胞仪检测MM细胞内钙水平结果显示：细胞外的钙能够激活NCX1，促使外钙内流，而KB-R7943会逆转CaCl2诱导的细胞内钙水平增高，BAPTA-AM具有同样的作用；CCK8结果显示CaCl2减弱MM细胞对BTZ的敏感性，而这种作用会被KB-R7943或BAPTA-AM逆转。<br>　　5.WesternBlot技术、共聚焦显微镜及电镜观察结果显示CaCl2促进MM细胞自噬通量增加，抑制NCX1或加入BAPTA-AM能够逆转该现象；CCK8、集落形成实验及流式细胞仪结果证实抑制自噬能够增加高表达NCX1细胞对BTZ的敏感性。<br>　　6.转录组测序KEGG结果分析显示抑制NCX1会影响NF-κB信号通路。WesternBlot结果显示NCX1促进非经典NF-κB相关蛋白表达（p100、p52、RelB）的表达，而不影响经典NF-κB相关蛋白表达；非经典NF-κB通路抑制剂（SN52）及靶向抑制NFκB2/p52会逆转过表达NCX1诱导的p100、p52、RelB蛋白及自噬相关蛋白（P62、ATG5、ATG7、LC3）的表达；此外，SN52减弱MM细胞中NCX1/BTZ诱导的p52和RelB核转位；电镜结果显示SN52同样减弱NCX1/BTZ增加自噬体数量的作用；荧光素酶报告实验结果显示过表达NFκB2可以促进NCX1的转录活性。<br>　　7.小鼠荷瘤模型结果显示，与单一干预措施相比，敲低NCX1或KB-R7943与BTZ协同抑制肿瘤生长；肿瘤组织的免疫组化结果显示，抑制NCX1协同BTZ抑制Ki67的蛋白表达，并可逆转BTZ诱导ATG5及ATG7的表达增加。<br>　　结论：<br>　　NCX1在MM中高表达，抑制NCX1表达干扰细胞内钙稳态，通过非经典NF-κB信号通路抑制自噬通量，进而增加MM细胞对BTZ的敏感性。此外，抑制NFκB2活性同样可以抑制NCX1的表达，因此形成正反馈增强MM对BTZ的敏感性。本课题揭示MM发病及其对BTZ敏感性的作用机制，为改善骨髓瘤患者预后及疗效提供新的靶点和新思路。