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摘要目的<br>　　通过CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除系统，筛选并鉴定B-ALL耐药相关基因。了解B-ALL中SUMO2介导的SUMOylation修饰及其涉及的肿瘤信号通路变化，探讨与药物化疗敏感性的关系，进一步研究SUMOylation修饰对B-ALL细胞生长的调控机制以及靶向干预的可能性，并试图寻找其与肿瘤耐药的相关可能机制，了解耐药ALL的发生机理。<br>　　方法<br>　　（1）通过CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除方法进行耐药相关基因的功能性筛选，通过文库慢病毒感染ALL细胞，以蒽环类代表阿霉素为筛选药物，进行为期14天的共培养。提取各组细胞基因组DNA，通过NanoDrop紫外吸收光谱、QubitDNA定量检测基因组DNA质量。通过全基因组测序分析sgRNA富集程度，对测序数据进行质控，通过分析sgRNA分布特征、自平衡文库分析，以分析测序结果的可靠性。结合生物信息学分析筛选耐药基因，获得相关基因列表。<br>　　（2）通过文库内部多条SUMO2-sgRNA验证SUMO2为B-ALL耐药相关基因，通过TheCancerDependencyMap数据眼验证SUMO2为B-ALL耐药相关基因。通过WesternBlot、RT-qPCR分别在B-ALL耐药细胞、临床患者样本中验证SUMO2的表达，并通过公共数据库CancerCellLineEncyclopedia验证，并通过TARGET数据库验证SUMO2的高表达与不良预后相关。WB检测化疗药物诱导B-ALL细胞出现deSUMOylation。通过CRISPR/cas9基因编辑技术敲除SUMO2，MTT检测细胞增殖情况，并检测细胞对化疗药物的敏感性。使用敲除SUMO2的Nalm6细胞构建BALB/C裸鼠移植瘤模型，检测SUMO2敲除的B-ALL细胞的体内增殖情况。MTT检测SUMOylation通路抑制剂ML-792、TAK-981、2-D08单用或联合化疗药物对B-ALL细胞系的体外杀伤作用，应用CompuSyn软件计算CI、DRI指数分析药物联用的作用。构建NAR细胞移植NCG小鼠模型，检测SUMOylation通路抑制剂ML-792、TAK-981、2-D08单用或联合化疗药物对B-ALL体内治疗作用，活体成像仪监测小鼠模型白血病进展情况。<br>　　（3）通过基于LC-MS/MS的TMT标记定量蛋白组学及抗体富集的非定量PTMs组学，鉴定B-ALL中SUMOylation修饰的蛋白，通过对提取的蛋白质进行分离、酶切，经胰酶酶解和LC-MS/MS分析得到肽段及蛋白的定性和相对定量结果，分析数据获得差异显著SUMOylation位点对应的蛋白。再通过对候选蛋白进行功能分析，主要包括位点motif分析，差异位点表达模式等分析，研究候选蛋白及其涉及的肿瘤信号通路，并探索以候选蛋白为靶点的治疗方案。<br>　　结果<br>　　（1）成功构建CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除的Nalm6细胞文库，进行为期14天的筛选，提取质量合格的基因组DNA，高通量测序获得确信度高的数据，结合生物信息分析，将SUMO2鉴定为B-ALL耐药相关基因。<br>　　（2）通过文库内部验证及外部数据集验证SUMO2为B-ALL耐药相关基因。公共数据库验证SUMO2在B-ALL中高表达，WB、RT-qPCR验证SUMO2及其介导的SUMOylation表达在耐药B-ALL细胞系中较亲本细胞高，在B-ALL临床样本中较健康供者表达高，数据库验证较高的SUMO2表达及其相关酶的高表达预示患者不良预后。<br>　　（3）化疗药物可诱导B-ALL细胞deSUMOylation，且呈时间和药物浓度依赖性。SUMO2敲除抑制了Nalm6细胞增殖，提高了药物敏感性，在体内体外均得到证实。SUMO2抑制剂与化疗药物呈协同作用，在体内体外均可提高Nalm6或NAR细胞的药物敏感性。<br>　　（4）SUMOylation修饰谱共鉴定到457个SUMOylation位点，对应437个SUMOylation蛋白，定义T检验后p值小于0.05和实验变量导致的logfoldchange大于1.2的蛋白的SUMOylation位点为显著性差异位点，其中显著差异位点分别有352个。在Nalm6与Nalm6ADM对比组中，有99个modifi在Nalm6中上调，253个modifi在Nalm6ADM中上调，85个modifi无明显统计学差异；在NAR与Nalm6对比组中，有238个modifi在NAR中上调，119个modifi在Nalm6中上调，80个modifi无明显统计学差异。提示SUMO2介导的SUMOylation途径可能是通过靶向相关蛋白质，影响细胞DNA转录过程，进而影响细胞药物敏感性。<br>　　结论<br>　　SUMO2作为B-ALL耐药相关基因，其介导的SUMOylation途径可能是通过RANBP2靶向相关蛋白质，影响细胞DNA转录过程，进而影响细胞药物敏感性。SUMOylation途径抑制剂可以协同化疗药物治疗B-ALL，靶向SUMO2介导的SUMOylation途径有望提高耐药B-ALL的疗效。