检索历史 清除

摘要目的:本研究的目的是从复发性流产与胎盘组织凋亡的相关性出发，探究滋养层细胞凋亡过程中发生的分子机制，揭示凋亡基因发生选择性剪接与滋养层细胞凋亡间的联系，挖掘凋亡基因发生选择性剪接新机制，并在BPDE(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide)诱发的细胞凋亡过程中进一步验证和干预。为滋养层细胞凋亡导致的复发性流产找到适当的诊断和干预措施提供更加科学的认识。<br>　　方法:<br>　　1、采用高通量测序检测健康对照（HC）和复发性流产（RM）组中基因的表达水平，采用GO分析将差异基因进行富集，并采用蛋白质免疫印迹（WesternBlot)在HC和RM组中检测促凋亡基因的蛋白水平。<br>　　2、采用Westernblot在HC和RM组中检测剪接因子SRSF1的蛋白水平，并通过核酸电泳验证其对于Caspase2的剪接调控。<br>　　3、采用流式细胞术和TUNEL实验检测BPDE、SRSF1、Caspase2L、对细胞凋亡的影响。<br>　　4、采用蛋白稳定性实验检测BPDE对于SRSF1的蛋白水平的影响。<br>　　5、采用免疫共沉淀(Co-Inmunoprecipitation)实验检测USP4与SRSF1的相互作用，及lnc-HZ09对此相互作用的影响。<br>　　6、采用免疫共沉淀(Co-Inmunoprecipitation)实验检测-USP4、±lnc-HZ09后SRSF1的泛素化水平。<br>　　7、采用RIP+RNApulldown实验检测SRSF1与caspase2的相互作用。<br>　　8、构建Benzo(a)pyrene(BaP)染毒小鼠流产模型，干预srsf1对流产和凋亡蛋白的回复作用。<br>　　结果:<br>　　1、Caspase2的选择性剪接导致的滋养层细胞凋亡介导复发性流产组织高水平凋亡。<br>　　2、SRSF1作为Caspase2的剪接因子在复发性流产组织中高表达并且能够促进滋养层细胞凋亡。<br>　　3、SRSF1结合到Caspase2pre-mRNA的exon10的剪接增强子（ESE）上促进其剪接。<br>　　4、BPDE上调SRSF1的蛋白水平并促进其蛋白稳定性。<br>　　5、BPDE通过上调lnc-HZ09促进去泛素化酶USP4与SRSF1的相互作用抑制SRSF1的泛素化降解而上调其蛋白水平。<br>　　6、Lnc-HZ09与Caspase2的exon10形成RNA-RNAduplex。<br>　　7、BPDE促进滋养层细胞凋亡的细胞模型中凋亡基因表达上调且干预SRSF1能够回复BPDE导致的凋亡。<br>　　8、BaP导致的孕鼠流产模型中，干扰srsf1能够有效降低BaP导致的流产率上调和凋亡蛋白的是上调。<br>　　结论:本研究表明，剪接因子SRSF1结合在Caspase2exon10的ESE序列上，增强exon9的跳跃，最终上调促凋亡基因Caspase2L的蛋白水平导致滋养层细凋亡；此外，环境毒物BPDE来源的lnc-HZ09，介导去泛素化酶USP4与SRSF1的相互作用进而抑制SRSF1的泛素化降解，进而上调其蛋白水平，阐明了剪接因子高表达的原因。希望能够为由于滋养层细胞凋亡而导致流产的诊断和干预提供科学的认识和思路。