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摘要目的利用人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1）包装系统构建复制缺陷型的不同变异株（Variant）假型化新冠病毒（SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2），用于替代野生病毒在生物安全二级（Biologicalsafetylevel2，BSL-2）实验室中开展抗体微量中和试验。对蛋白表达等条件进行优化后，建立抗体微量中和试验方法。应用该方法，开展疫苗加强接种后人群不同阶段血清抗体对三种病毒变异株（Wuhan-Hu-1参考株、Delta和Omicron变异株）的中和滴度动态变化，以及不同特征的免疫个体所产生的中和抗体滴度及其与病毒感染后临床表现（临床症状类型数量、核酸检测阳性状态的持续时间）之间关系，为疫苗加强接种引发的免疫保护能力提供初步认识，有助于制定或改进未来的SARS-CoV-2的免疫防控策略。<br>　　方法<br>　　1、从福建省新冠病毒核酸阳性样本中提取病毒RNA，应用RT-PCR扩增获取全长S蛋白编码基因；对S蛋白编码基因进行密码子优化后，应用PCR技术，获得S蛋白C末端缺失13个和19个氨基酸（Aminoacid,aa）的编码序列；构建密码子非优化或优化、全长或不同C末端长度的6种SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1参考株S蛋白表达质粒；<br>　　2、利用上述S蛋白表达质粒和HIV慢病毒假型化系统，构建SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1参考株假型化病毒并筛选最优表达质粒类型；利用免疫荧光验证S蛋白表达并对假型化病毒进行筛选；在此基础上，构建假型化Delta和Omicron变异株病毒；<br>　　3、比较假型化SARS-CoV-2与野生病毒微量中和试验的相关性和一致性；选取加强免疫后人员作为研究对象，采集研究对象加强免疫后第1、3、6个月血液样本；同时收集受试者性别、年龄等基本信息；采用假型化病毒微量中和试验检测血清中新型冠状病毒中和抗体滴度，结合受试者的流行病学资料，统计并分析受试者加强免疫后的抗体体外中和新冠病毒效果。<br>　　结果<br>　　1、成功扩增并克隆SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1参考株全长S蛋白编码区，按照哺乳动物细胞表达的偏嗜性，对其进行密码子优化；应用PCR方法，成功获得C末端缺失13个和19个氨基酸的S蛋白编码序列；在此基础上，成功构建了含有全长、C末端分别缺失13aa和19aa的原始（W-S1、W-△S13、W-△S19）和经密码子优化（W-OS1、W-△OS13、W-△OS19）的S蛋白编码区的6种表达质粒。将上述6种质粒分别转染293T细胞，通过筛选，W-△OS13的刺突蛋白表达水平相对较高（Pgt;0.05），据此，进一步构建Delta和Omicron变异株表达质粒D-△OS13、O-△OS13，并通过免疫荧光分析验证刺突蛋白在293T细胞中的表达；<br>　　2、将筛选的表达质粒和含有萤火虫萤光素酶的HIV慢病毒包装系统共转染到293T细胞中，成功制备三种变异株的SARS-CoV-2假型化病毒。收集病毒上清液并感染Vero-E6细胞，通过测定假型化病毒感染Vero-E6细胞中萤火虫荧光素的相对发光单位（Relativeluminescenceunits，RLU），优化了包装质粒与目的质粒比例、转染总质粒DNA与Lifectamine3000比例，以及病毒收集和感染细胞中萤火虫荧光素检测的时间点。结果表明，包装质粒：目的质粒=3:1，转染总质粒DNA:Lifectamine3000=1:2的条件下制备的假型病毒滴度较高（Plt;0.05）。将质粒共转染293T后24h收集假型化病毒时，所获病毒的滴度最高（P＜0.0001）；萤火虫荧光酶素在假型化病毒感染细胞中的表达效率在感染后48h达到最高水平，在感染后72h、96h显著降低（P＜0.0001）；<br>　　3、抗体中和滴定试验显示，三种假型化病毒（W-△OS13、D-△OS13和O-△OS13）与相应的野生病毒（Wuhan-Hu-1、Delta和Omicron）具有很强的相关性（R2分别为0.9150、0.8984和0.7990，Plt;0.001）和一致性（Bland-Altman图可见大部分数据点落在95%一致性界限之内；ICC分别0.957、0.943和0.880，Plt;0.001）；<br>　　4、共从117人（男63人，女55人，平均年龄42.92（23～62）岁）中采集了201份血液样本。使用不同的变异株假型化病毒检测I期（加强后1个月±14天）、II期（加强前3个月±14天）和III期（加强后6个月±14天）血清中抗体的中和滴度。结果表明，三种假型化病毒血清中和抗体滴度不同（P＜0.05），W-△OS13抗体的中和滴度在I～II阶段过程中增加，而在II～III阶段过程中减少（Plt;0.0001）。D-△OS13抗体的中和滴度在I～III阶段过程中持续下降（Plt;0.0001）。O-△OS13抗体的中和滴度在I～II阶段呈快速下降至极低水平（Plt;0.01），II～III阶段下降趋势不明显（Pgt;0.05）。<br>　　连续采样的28个人（男11人，女17人，平均年龄42.85（28～58）岁）的抗体中和滴度的动态变化趋势与上述结果类似。W-△OS13抗体的中和滴度从I～III阶段，呈现先升高后降低趋势，总体下降1.69倍（Plt;0.0001）；D-△OS13则持续下降，II～III阶段分别比前一阶段下降1.55倍（Plt;0.0001）和1.44倍（Plt;0.01），总体下降2.24倍（Plt;0.0001），O-△OS13从I～II显著下降（总体下降了4.43倍，Plt;0.0001），但II～III阶段没有降低不明显（Pgt;0.05）。<br>　　比较加强免疫后各阶段针对不同假型化病毒的抗体的中和滴度中位数，结果表明，在第I阶段，D-△OS13和O-△OS13的中和滴度中位数分别比W△OS13低3.12倍和34.25倍（Plt;0.0001），O-△OS13比D△OS13低10.76倍（Plt;0.05）。在第II阶段，D-OS13和O-△OS13的中和滴度中位数分别比W-△OS13低7.26倍和277倍，O-△OS13比D-△O13低38.15倍（Plt;0.0001）。在第III阶段，D-△OS13和O-△OS13的中和滴度中位数分别比W-△OS13低4.54倍和124.4倍（Plt;0.0001）。<br>　　5、对性别、年龄和基础性疾病等进行分层分析，结果表明，加强免疫后，不同性别和年龄的人群对特定变异株的抗体中和滴度不同。女性的O-△OS13中和抗体水平高于男性（Plt;0.05）；≥50岁年龄组W-△OS13中和水平较低（Plt;0.0001）；然而，基础疾病与加强免疫后抗体中和滴度水平之间没有相关性（P＞0.05）。本研究中所有个体第一剂和第三剂（加强免疫）的时间间隔为210至350天，中位数为280天。W-△OS13抗体的中和滴度在≤280天的时间间隔内产生的高于gt;280天的（Plt;0.05），但在针对其他两种变异株（D-△OS13和O-△OS13）的抗体中没有观察到类似的现象（P＞0.05）。<br>　　6、经随访，共有75人在加强免疫后感染了SARS-CoV-2（经核酸阳性结果证实）。这些个体的症状有所相同，核酸阳性的持续时间也不同。中和试验表明，上述个体中，症状≤5种的个体的W-△OS13抗体中和滴度高于症状＞5种的个体（Plt;0.05），核酸阳性持续时间≤7天的个体的W-△OS13抗体中和滴度高于症状＞7天的个体；但分析针对其他两种变异株（D-△OS13和O-△OS13）的抗体中和滴度时，没有观察到类似的现象（P＞0.05）。<br>　　结论<br>　　1、通过对SARS-CoV-2刺突蛋白表达的优化，成功构建了三种SARS-CoV-2假型化病毒（W-△OS13，D-△OS13和O-△OS13），并通过免疫荧光实验证实其可在细胞内表达；通过优化包装质粒与目的质粒的比例（3:1）、总转染质粒DNA与Lifectamine3000的比例（1:2），成功获得高滴度、可用于抗体中和试验的假型化病毒；通过测定假型化病毒上清收集时间（24h）和病毒感染细胞时间（48h），建立了基于假型化病毒的微量中和试验方法；应用本研究构建的假型化病毒与对应的野生病毒，测定三种SARS-CoV-2变异株中和抗体滴度，两者的结果具有良好的相关性和一致性。<br>　　2、加强疫苗接种诱导的抗体中和各种SARS-CoV-2变异的能力各不相同。加强针接种后1个月收集的抗体对Wuhan-Hu-1参考株显示出高中和滴度，对Delta和Omicron变异株显示出低中和滴度。Wuhan-Hu-1参考株病毒抗体的中和滴度在短时间内上升，但随着时间的延长，血清中所有三种变异株的滴度普遍下降，最长可达6个月。对于新出现的SARS-CoV-2变异株，其滴度与Wuhan-Hu-1参考株相比下降得更快，提示新出现变异株具有免疫逃逸的能力。在纳入本研究的个体中，我们发现男性或lt;50岁的人对Wuhan-Hu-1参考株的抗体中和滴度相对较高。抗体的中和滴度可能与第一次接种和加强针接种（第三次接种）之间的时间跨度有关，同时，抗体的中和效价可能会影响SARS-CoV-2感染者加强针接种后核酸阳性的症状和持续时间（突破性感染）。