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摘要肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其按照组织学分类可分为占比约为85%的非小细胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）和约为15%的小细胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）。目前NSCLC患者仍以化疗为主要治疗方式，但连续或多次给药易导致患者耐药，为NSCLC化疗失败的主因。研究表明：血浆中microRNA（miRNA）的异常表达与NSCLC患者耐药紧密相关。基于血浆中miRNA在患者体内表达水平的相对稳定性，通过研究NSCLC患者在化疗药物及靶向药物干预前后血浆中特定miRNA表达水平的变化，可有效评估病人的耐药情况，为精准诊断、精准预测及精准治疗提供有力的临床数据支持。<br>　　对比传统的分析方法，荧光生物传感器因其仪器设备简单、易操作、响应速度快、成本低等特点被广泛用于疾病诊断、细胞成像等领域。以荧光技术为基础，本文将具有分离特性的磁珠与外切酶辅助的信号放大策略相结合，设计了两步信号循环放大的荧光分析方法，并尝试将构建传感器用于临床样本中NSCLC耐药相关miRNA的定量分析，研究内容包括以下两个部分：<br>　　第一章：基于磁珠分离及ExonucleaseIII核酸外切酶循环放大技术的荧光传感器用于microRNA-34a（miR-34a）的检测<br>　　本章节利用核酸外切酶III（ExonucleaseIII，ExoIII）对双链DNA高度特异性降解特性，设计了发夹探针HP、存在部分互补配对关系的捕获探针S1和信号探针S2，结合磁珠分离与两步信号循环放大策略构建出荧光传感器用于miR-34a的测定。具体设计如下：S1和S2的3''末端均标记羧基荧光素（FAM）荧光团，S1探针5''端标记的生物素可与磁珠表面修饰的链霉亲和素结合。当目标链存在时，可与HP互补形成杂合双链，启动第一步酶促放大反应，ExoIII通过识别并剪切发夹探针的3''端，释放出miRNA和一段DNA扩增序列进入溶液相，前者将继续进行第一步循环扩增反应，而后者的存在将触发第二步酶切反应；扩增出的DNA片段可与固定在磁珠上捕获探针S1互补，亦被ExoIII降解并释放捕获探针3''末端的FAM基团，随着捕获探针S1被消化，信号探针亦游离到溶液相中，二者均能在分离磁珠过后的上清液中产生较强的荧光信号。在10.0fM~10.0nM范围内，荧光信号变化值（ΔF）与miR-34a的浓度呈现良好的线性关系，检测限可达1.0fM。在人血浆样本加标实验中，可实现对miR-34a的准确定量。将该方法应用于临床血液样本中目标miRNA的检测，结果表明该方法能准确评估肺癌患者全血中miR-34a的表达信息，其检测结果与RT-qPCR高度一致。<br>　　第二章：基于磁珠分离及ExonucleaseT7（ExoT7）核酸外切酶辅助的循环放大技术构建的荧光传感器用于miR-21和miR-155的同时检测<br>　　本章节设计了两组发夹探针H1/H2和信号探针S1/S2，在磁性分离的基础上，构建了ExoT7酶介导的两步信号放大的荧光传感器，用于miR-21和miR-155双目标组分的检测。根据待测目标的不同，分别在发夹探针和信号探针的5''端修饰荧光基团。具体设计如下：H1/S1标记FAM，用于识别miRNA-21；H2/S2标记6-羧基-X-罗丹明（ROX），可与miR-155互补配对，且探针的3''端均修饰了生物素。当靶标存在于体系中时，发夹探针可与目标miRNA杂交，形成杂合双链，随后杂合双链被ExoT7特异性识别从5''端剪切，释放出目标miRNA、未被完全降解的单链DNA片段及荧光基团。游离出的目标miRNA可触发下一轮杂交和酶促反应，继而从发夹探针中释放更多的DNA扩增片段。信号探针可与该扩增片段杂交并启动第二步信号放大反应，形成的5''平末端随后被T7外切酶识别并降解，游离出扩增片段和荧光基团，前者将继续触发信号探针的下一轮杂交-酶降解-再杂交的循环反应。游离于溶液相中的荧光基团可产生相应的荧光响应信号，而未参与酶促反应的探针则通过生物素-链霉亲和素作用力与磁珠偶联，在磁力作用下未反应的探针不会对溶液相的信号产生干扰。在最佳条件下，miR-21和miR-155检测的线性范围分别为1.0pM~10.0nM和10.0pM~10.0nM，检测限分别为0.1pM和10.0pM；特异性实验表明在同一溶液体系中可实现目标miRNA与其他NSCLC耐药相关miRNA的有效区分，方法呈现良好的选择性，提示方法具备实际临床样本中多miRNAs同时检测的潜力。