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摘要【目的】<br>　　结直肠镜检结合病理检查是诊断结直肠癌（CRC）的金标准，但由于其具有侵入性、耗时长、易引起并发症等特点尚无法广泛推广；粪便隐血试验（FOBT）和血清肿瘤标志物如CEA和CA19-9等的检测，无创易操作，但其易受到肿瘤部位的影响、敏感性和特异性较低。血浆Septin9基因甲基化（mSEPT9）近几年逐渐在临床上得以推广，用于CRC的筛查，临床通常使用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测mSEPT9，但该方法在检测低浓度样本时灵敏度较低，存在局限性。而微流控芯片式数字PCR（dPCR）具有高敏感性、特异性、精准性等优点，特别适用于检测低浓度样本。为了克服现有CRC检测方法的不足，本研究旨在建立锁核酸（LNAs）修饰的微流控芯片式dPCR检测mSEPT9的方法，并将其应用于CRC的筛查、诊断，有助于CRC的早诊早治。<br>　　【方法】<br>　　1.微流控芯片式dPCR检测mSEPT9方法的建立<br>　　根据Septin9基因的CpG岛高甲基化位点，设计LNAs修饰的甲基化特异性引物和探针，同时构建质粒标准品，并使用qPCR技术验证甲基化检测体系的特异性。优化反应条件（变性时间和退火/延伸温度）和反应体系（引物和探针终浓度），建立qPCR检测mSEPT9方法，并以此为基础构建微流控芯片式dPCR检测方法。<br>　　2.微流控芯片式dPCR检测mSEPT9的方法学评价<br>　　以美国临床和实验室标准化协会（CLSI）发布的EP15-A3和中国合格评定国家认可委员会（CNAS）发布的《临床化学定量检验程序性能验证指南》和《分子诊断检验程序性能验证指南》为依据，使用自建质粒标准品对qPCR和微流控芯片式dPCR检测方法学进行性能评价，包括精密度、检出限、正确度、特异性及线性范围等评价指标。<br>　　3.微流控芯片式dPCR检测mSEPT9方法的临床应用评价<br>　　应用自建微流控芯片式dPCR检测方法和市售商品化qPCR检测试剂盒检测相同样本的mSEPT9，并对二者的性能（诊断灵敏度、特异性等）进行比较；采用受试者工作特征（ROC）曲线评估微流控芯片式dPCR检测mSEPT9的临床应用价值，并将其与传统的CRC相关肿瘤标志物进行比较，探究其临床应用价值。<br>　　【结果】<br>　　1.微流控芯片式dPCR检测mSEPT9方法的建立<br>　　通过综合性DNA甲基化数据库Methbank预测Septin9基因V2转录本的差异性CpG位点，并使用oligo7软件设计引物和探针，同时制备了甲基化质粒pMD-18T-mSeptin9和非甲基化质粒pMD-18T-Septin9标准品。qPCR法和微流控芯片式dPCR法的最适反应条件和反应体系相一致，其最适变性时间为5s，最适退火/延伸温度为60℃，最适引物和探针终浓度分别为0.2μM和0.1μM。<br>　　2.微流控芯片式dPCR检测mSEPT9的方法学评价<br>　　qPCR检测方法的线性范围为108copies/μL~101copies/μL，检出限为101copies/μL，平均回收率为108.72%；而微流控芯片式dPCR检测方法的线性范围为104copies/μL~100copies/μL，检出限为100copies/μL，平均回收率为103.96%。两种检测方法的特异性好、对混合样本检出能力强。qPCR检测高（106copies/μL）、低（102copies/μL）2种浓度甲基化质粒标准品Ct值的批内变异系数（CV）分别为0.66%、0.57%，批间CV分别为3.54%、2.37%，而微流控芯片式dPCR检测高（104copies/μL）、低（101copies/μL）2种浓度甲基化质粒标准品拷贝数的批内CV分别为6.35%、3.50%，批间CV分别为10.70%、3.57%；两种检测方法精密度较好，结果稳定。<br>　　3.微流控芯片式dPCR检测mSEPT9方法的临床应用评价<br>　　在对95例已确诊为CRC的患者和23例肠镜检查阴性的健康对照者的临床标本进行检测时，市售商品化qPCR检测试剂盒诊断CRC的敏感性为58.95%，特异性为91.30%；而自建微流控芯片式dPCR方法的诊断敏感性为82.11%，诊断特异性为95.65%，两种方法的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.751和0.889。此外，自建方法在不同CRC阶段的检测阳性率均高于市售商品化试剂盒，特别是I期的诊断敏感性有较大幅度的提高。因此，自建微流控芯片式dPCR具备更高的诊断能力。<br>　　此外，相关肿瘤标志物CEA和CA19-9在CRC患者中的阳性率分别为54.26%和17.02%，均低于自建微流控芯片式dPCR方法的诊断敏感性。而mSEPT9与CEA联用可提高CRC诊断敏感性至91.49%，明显高于其他联合指标。<br>　　【结论】<br>　　成功建立了LNAs修饰的微流控芯片式dPCR定量检测mSEPT9的方法，该方法准确可靠、精密度佳、检出限低、线性范围好、操作简便，相较于当前qPCR检测方法，具备更好的临床应用价值。此外，微流控芯片式dPCR检测mSEPT9的方法具备较高的CRC诊断敏感性，结合CEA可进一步提高CRC的诊断敏感性，其可用于CRC筛查，值得推广应用。