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摘要目的：复方肾华片（Fufang Shenhua tablet，SHT）是一种治疗肾脏病的中成药，它以黄芪为君，以女贞子，莪术为臣，白术、白芍、三棱、金银花为佐药，适用于治疗慢性肾炎、蛋白尿及伴有早中期肾功能不全的患者，中医症候为气阴两虚证和瘀毒互结者。临床上有效降低慢性肾炎、慢性肾功能不全患者的蛋白尿、血清肌酐和尿素氮，提高血浆白蛋白，减轻肾脏的病理改变，改善血液流变学指标。慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）是一种常见的疾病，其在全球范围内已成为主要的公共卫生问题之一。肾间质纤维化是CKD发病机制的共同特征之一，其主要与细胞外基质（ExtracellμLar matrix，ECM）过度沉积有关，从而导致肾功能的进行性下降。然而，SHT对CKD晚期纤维化的治疗效果及其作用机制尚缺乏深入的研究。此外，SHT 中哪些成分是主要的药效物质目前仍未确定。为了探讨SHT对CKD干预作用及其可能的分子机制，本研究选用5/6肾切除术建立大鼠CKD模型，并利用网络药理学、分子对接和实验验证等多种方法，共同揭示其发挥疗效的作用机制。<br>　　方法：（1）本实验选用36只SD大鼠，随机分为6组，分别为假手术组（Sham）、模型组（Model）、厄贝沙坦阳性对照组（IRB）、复方肾华片低、中、高剂量组（SHTL、SHTM、SHTH）。除Sham组外其余五组大鼠均进行5/6肾切除术以建立CKD模型。实验12周后，检测大鼠的血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）和 24h 尿蛋白（PRO）水平。采集肾脏组织样本进行 PAS和 Masson 病理染色，并运用免疫荧光法、免疫组织化学染色法、Western blot 技术检测纤连蛋白（Fibronectin，FN）、I型胶原蛋白（Collagen I，COL-I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平，以评估纤维化的相关指标。<br>　　（2）运用网络药理学和生物信息学技术，结合TCMSP数据库和大量文献检索，筛选出SHT中的活性成分，并利用TCMSP、Swiss Target Prediction和PubChem数据库鉴定其对应的蛋白质靶点。检索GEO数据库相关CKD基因芯片数据，分析差异基因，获取CKD疾病相关靶点，从而得到SHT和CKD之间的交集靶点作为候选目标。构建SHT活性成分-靶点、蛋白-蛋白相互作用网络，进行网络可视化和拓扑分析，并运用GO功能富集和KEGG富集分析预测SHT治疗CKD的主要成分、关键靶点及信号通路。为验证分析的准确性，在PDB数据库下载靶蛋白的3D结构，利用Pymol软件和AutoDockTools软件进行分子对接和可视化处理。<br>　　（3）为了验证SHT对CKD的干预作用机制，本研究采用了体内实验和体外实验进行网络药理学分析验证。我们针对 SHT 干预 CKD的关键靶点和信号通路，使用RT-qPCR技术检测肾脏组织中AKT1、VEGFA、MYC、IL2等关键靶点的mRNA表达量，以及Western blot技术检测肾脏组织中PI3K/AKT信号通路蛋白表达情况。此外，我们还通过TGF-β1刺激诱导HK-2细胞模拟EMT过程中ECM的分泌增多，并使用 SHT、槲皮素（根据网络药理学分析活性成分排名第一）以及PI3K/AKT 激动剂进行干预。使用 Western blot 技术检测细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白变化情况，并利用RT-qPCR技术检测纤维化α-SMA、FN、COL-I等mRNA表达量。<br>　　结果：（1）本实验对接受5/6肾切除和假手术的大鼠进行了检测。SCr、BUN 和 24 小时 PRO 水平检测结果表明，5/6 肾切除组大鼠的SCr、BUN和24小时PRO水平明显升高，表明肾脏功能出现了明显损害，而假手术组未出现此现象，说明CKD模型成功建立。SHT治疗组和阳性药物组，能够显著改善大鼠的肾功能，并减少肾脏病理损伤和纤维化的指标，表明SHT对CKD具有一定的治疗作用。<br>　　（2）采用网络药理学，发现SHT中含有62种具有活性的化合物，其中槲皮素排名第一，同时涉及105个与CKD相关的蛋白靶点。通过构建 PPI 和 SHT-CKD-信号通路网络，我们确定 AKT1、MYC、IL2、VEGFA为SHT对CKD作用的关键靶点。此外，我们通过GO和KEGG通路富集分析，预测了 SHT 对 CKD 肾脏保护作用的机制，发现与PI3K/AKT信号通路密切相关。分子对接结果进一步证明了SHT的活性成分与核心靶点之间存在强烈的结合亲和力。<br>　　（3）本研究通过体内实验验证，发现SHT能够降低5/6肾切除大鼠肾脏中AKT1、MYC、IL2的mRNA水平。通过使用Western blot检测，我们发现SHT对各治疗组AKT和PI3K的总表达水平几乎没有影响，但是可以显著降低肾脏中PI3K和AKT的磷酸化水平。这表明， SHT可以通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。同时，本研究还进行了体外实验验证，在TGF-β1刺激HK2细胞后，发现p-PI3K和p-AKT的表达水平明显升高，α-SMA、FN、COL-I的表达水平也明显升高。然而，SHT和槲皮素的干预治疗能够明显降低p-PI3K和p-AKT蛋白的表达水平，同时 α-SMA、FN、COL-I 的表达水平也明显降低。这说明SHT和槲皮素对TGF-β1诱导的HK2细胞纤维化模型具有治疗作用，并且对PI3K/AKT信号通路具有抑制作用。最后，我们使用广谱PI3K/AKT激动剂（740 Y-P）激活PI3K/AKT通路，发现SHT对肾纤维化的抑制作用被阻断。<br>　　结论：本研究采用网络药理学方法探索SHT对CKD肾脏纤维化的可能作用靶点，并在5/6肾切除制备的CKD动物模型和TGF-β1刺激的HK2细胞中进行实验验证，揭示了SHT通过影响PI3K/AKT信号通路改善CKD肾脏纤维化的机制。