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脂肪间充质干细胞治疗1-溴丙烷致大鼠神经损伤的作用研究

摘要目的<br>  1-溴丙烷(1-Bromopropane,1-BP),是常用的工业有机溶剂,多应用于精密仪器清洗剂、喷雾黏合剂和脱脂剂。又因其易挥发、不易燃、在大气中半衰期短、不破坏大气臭氧层,被作为含氟制冷剂的替代物广泛使用。我国溴资源丰富,作为溴的主要进出口国,职业接触人群相对较多。自1999年报告首例1-BP职业中毒以来,国内外陆续出现1-BP职业中毒病例。目前,对于1-溴丙烷中毒治疗主要以治疗神经损伤为主。迄今,1-BP中毒机制研究任未完全阐明,临床尚无特效药物,提供有效方式修复1-溴丙烷致神经损伤具有重要意义。<br>  随着细胞工程的深入开展,干细胞作为目前细胞工程最具潜力种子细胞,用于神经损伤修复已成为当下热点。脂肪间充质干细胞(Adipose-derivedMesenchymalStemCells,ADMSCs)来源广泛、侵入性小、容易提取及无免疫原性、可分泌多种神经生长营养因子促进神经损伤的修复。<br>  本研究通过大鼠经口染毒1-溴丙烷,建立1-BP致大鼠周围神经损伤模型,采用尾静脉注射ADMSCs治疗,观察ADMSCs对1-BP致神经损伤的修复作用,通过检测大鼠运动皮质氧化应激水平及神经生长营养因子蛋白的表达初步探讨ADMSCs治疗1-BP致大鼠神经损伤的可行性。<br>  方法<br>  1.大鼠来源脂肪间充质干细胞的分离培养与鉴定<br>  取5只无特定病原体级SD雌性大鼠腹股沟旁脂肪组织,经消化、过滤、重悬等操作后提取ADMSCs进行细胞培养,传代至第4代,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD31、CD45和CD106,鉴定干细胞来源,并取第5代ADMSCs进行成骨、成脂、成软骨诱导,鉴定其分化能力。<br>  2.1-溴丙烷致大鼠神经损伤模型的建立<br>  无特定病原体级SD雄性大鼠45只适应性喂养5d,随机分为对照组(15只)和模型组(30只)。模型组大鼠予剂量为800mg/kg体质量1-溴丙烷(玉米油配制)灌胃染毒,对照组予等体积玉米油灌胃,每日1次,每周5d,连续染毒10周,建立1-溴丙烷致大鼠神经损伤模型。<br>  3.ADMSCs治疗1-溴丙烷中毒致大鼠神经损伤的作用研究<br>  随机将模型组大鼠分为自行恢复组和ADMSCs组,每组12只。ADMSCs组大鼠予尾静脉注射0.5ml(含1×106个)ADMSCs细胞悬液,自行恢复组大鼠予等体积PBS溶液,每周1次,连续4周;对照组大鼠不予任何处理。在ADMSCs治疗前1天和治疗后第7、14、21、28天,对各组大鼠进行斜板实验和BBB评分。治疗结束后,分离大鼠大脑、坐骨神经进行病理组织学检查,采用蛋白印迹法(WesternBlotting)检测大脑皮质及坐骨神经的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、睫状神经营养因子(CiliaryNeurotrophicFactor,CNTF);采用试剂盒检测大脑运动皮质氧化应激指标表达水平。<br>  结果<br>  1.成功分离培养出脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测干细胞表面标记结果为:CD29阳性表达,CD31、CD45和CD106阴性表达。<br>  2.神经行为评分:步态评分结果显示,染毒4周,模型组步态评分为1.57±0.14,随着染毒时间的延长,模型组大鼠步态评分逐渐增高,染毒第10周,1-BP致大鼠神经损伤模型建立成功,模型组步态评分为3.71±0.13,对照组为1.00±0.00。自第4周开始,模型组步态评分明显高于对照组,差异有统计学意义(Plt;0.05);行ADMSCs治疗后,治疗第2周,对照组、自行恢复组、ADMSCs组BBB评分分别为:三组评分分别为20.33±0.29、6.88±0.79、10.00±0.55,治疗第3周,三组评分分别为20.11±0.26、10.13±0.35、13.11±0.89,治疗第4周,三组评分分别为20.22±0.22、12.63±0.65、15.89±0.75。治疗第4周斜板实验评分三组分别为57.22±2.37、45.00±2.50、51.11±0.74。第2周至第4周,自行恢复组BBB评分明显低于ADMSCs组。第4周,自行恢复组斜板实验评分明显低于ADMSCs组。差异有统计学意义(Plt;0.05)<br>  3.HE染色:对照组海马神经元排列整齐,结构完整;坐骨神经神经纤维排列整齐,轴突和髓鞘结构完整紧密。模型组海马神经元细胞排列疏松、可见神经元变性坏死,坐骨神经可见少量施万细胞;模型组神经纤维排列絮乱,轴突和髓鞘结构崩解破坏、发生轴索变性、空泡化明显;自行恢复组海马病理表现与模型组类似,坐骨神经施万细胞增生核深染,神经纤维排列较为絮乱,少量空泡样变性;ADMSCs组海马神经元细胞坏死较自行恢复组有所减轻,坐骨神经神经纤维排列较为整齐、轴突和髓鞘结构较为完整。<br>  4.氧化应激指标:与对照组比较,模型组GSH含量减少,MDA含量增加,行ADMSCs治疗后,自行恢复组大脑皮层SOD活力、GSH含量减少,MDA含量增加;与自我恢复组2w比较,ADMSCs组2wSOD活力、GSH含量增加,MDA含量减少;与自我恢复组4w比较,ADMSCs组SOD活力增加(P均lt;0.05)。<br>  5.Westernblotting实验结果显示,与对照组比较,模型组大鼠大脑皮层运动皮质BDNF、CNTF表达水平、坐骨神经BDNF、VEGF表达水平降低。行ADMSCs治疗后,与自行恢复组2w比较,ADMSCs组2w运动皮质CNTF表达水平、坐骨神经BDNF、CNTF、VEGF表达水平升高,与自行恢复组4w比较,ADMSCs组4w运动皮质BDNF、CNTF表达水平、坐骨神经组BDNF、VEGF表达水平升高(P均lt;0.05)。<br>  结论<br>  1.ADMSCs移植可改善1-BP致大鼠神经损伤模型运动功能恢复。<br>  2.ADMSCs可通过抑制1-BP引起的脂质过氧化保护神经元,并旁分泌BDNF、CNTF、VEGF神经营养因子,促进神经修复和再生。

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学位信息:
广东药科大学 公共卫生与预防医学 公共卫生(硕士) 2023年
分类号 R996
发布时间 2024-07-05
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