摘要目的<br> 镉是人类在生活和工作环境中可能接触到的毒性最强的金属元素之一,镉可引起人体多种器官的生理损伤,包括肾脏和肝脏等。肝脏是人体主要的排毒器官,肝毒性是镉引起多种毒性作用中的一种,有研究发现,氧化应激、脂质过氧化、内质网应激以及金属离子紊乱等是镉暴露致肝脏损伤的重要机制,但是目前其对肝脏的损伤机制尚未完全阐明。铁死亡是一种铁依赖性的,区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式,活性氧以及内质网应激均被发现参与了铁死亡的发生。然而,有关镉对肝脏的损伤作用及铁死亡的关系目前报道甚少。因此,本研究拟以HepG2细胞为研究对象,用氯化镉以不同剂量和不同处理时间处理HepG2细胞,建立镉染毒模型,探究铁死亡是否参与了镉致HepG2细胞的损伤过程。并进一步选择内质网应激及活性氧抑制剂等,分别对相关信号通路进行干预,探究ROS-内质网应激轴在镉致肝细胞铁死亡中的作用机制,深入揭示镉的肝毒性作用机制。<br> 方法<br> 以人肝癌细胞HepG2进行体外实验。具体操作如下:<br> 取对数生长期的HepG2细胞进行实验,实验分组如下:用含终浓度为0、1、2、4、6、8、10、12、14、16μmol/L的CdCl2的完全培养基染毒24、48和72h;用含终浓度为5μmol/LFer-1的完全培养基预处理6h后,再用终浓度为8μmol/L的CdCl2的完全培养基染毒24和48h;用终浓度为20μmol/LErastin的完全培养基染毒24和48h;用含终浓度为10μmol/L的GSK的完全培养基预处理6h后,再用终浓度为8μmol/L的CdCl2的完全培养基染毒24和48h;用终浓度为15μmol/L的CQ的完全培养基预处理6h后,用8μmol/L的CdCl2的完全培养基染毒24和48h;用终浓度为10μmol/L的TEMPO的完全培养基预处理6h后,用8μmol/L的CdCl2的完全培养基染毒24和48h。染毒结束后,收集细胞,采用MTT比色法检测细胞活力,WST-8法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力,微板法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活力,硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(MDA)含量,DCFH-DA荧光探针法检测ROS含量,比色法检测细胞Fe离子含量,实时荧光聚合酶链式反应法(PCR)检测铁死亡相关基因GPX4和SLC7A11的mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测GPX4、SLC7A11、PERK、GRP78、LC3A/B、FTL蛋白的表达。<br> 结果<br> (1)细胞活力结果:当CdCl2浓度为1、2、4μmol/L和处理时间为24和48h时,细胞活力均无明显变化;染毒72h时,细胞活力增加(Plt;0.05),当CdCl2浓度为6~16μmol/L时,细胞活力降低(Plt;0.05),确定后续实验剂量为2、4和8μM。<br> (2)氧化应激结果:染毒24、48和72h后,2μM和4μMCdCl2组中SOD活力无明显变化,GSH含量升高,当CdCl2为8μM时,SOD活力和GSH含量均显著降低(Plt;0.05)。2μMCdCl2组MDA含量无明显变化,8μMCdCl2组MDA含量显著升高(Plt;0.05),ROS含量随染毒浓度以及时间的增加而增加(Plt;0.05)。<br> (3)铁死亡指标变化结果:在8μMCdCl2作用24、48和72h后,细胞内Fe含量显著增加(Plt;0.05)。铁死亡相关基因GPX4mRNA转录水平随着CdCl2浓度的增加而降低(Plt;0.05),SLC7A11mRNA转录水平升高(Plt;0.05)。GPX4蛋白表达水平降低(Plt;0.05),SLC7A11蛋白表达水平在作用时间为24和48h时无明显变化,在72h时增加(Plt;0.05)。<br> (4)Fer-1和Erastin对HepG2细胞活力以及氧化应激的影响:Fer-1预处理细胞6h后,与单独CdCl2处理组相比,细胞活力显著升高(Plt;0.05),SOD活力和GSH含量升高(Plt;0.05),MDA及ROS含量降低(Plt;0.05)。Erastin处理组细胞SOD活力及GSH含量降低(Plt;0.05),MDA和ROS含量增加(Plt;0.05)。<br> (5)Fer-1和Erastin对HepG2细胞铁死亡指标的影响:Fer-1预处理后细胞中Fe含量降低(Plt;0.05),GPX4mRNA转录水平升高(Plt;0.05),SLC7A11mRNA转录水平降低(Plt;0.05),GPX4蛋白表达水平增加(Plt;0.05),而SLC7A11蛋白表达水平无明显变化(Pgt;0.05)。与对照组相比,Erastin组Fe含量增加(Plt;0.05),GPX4mRNA转录水平降低(Plt;0.05),SLC7A11mRNA转录水平升高(Plt;0.05),GPX4蛋白表达水平降低(Plt;0.05),SLC7A11蛋白表达水平无明显变化(Pgt;0.05)。<br> (6)内质网应激与CdCl2诱导的HepG2细胞死亡的关系:随着CdCl2浓度的增加,细胞中的内质网应激蛋白GRP78和PERK的表达水平也随之升高(Plt;0.05)。<br> (7)内质网应激抑制剂GSK对HepG2细胞活力以及氧化应激的影响:10μM的GSK预处理6h后,与单独CdCl2处理组相比,细胞活力显著升高(Plt;0.05),抗氧化指标SOD活力及GSH含量升高(Plt;0.05),氧化指标MDA及ROS含量降低(Plt;0.05)。<br> (8)内质网应激抑制剂GSK对HepG2细胞铁死亡指标的影响:GSK预处理后,细胞中Fe含量降低(Plt;0.05),GPX4蛋白表达水平增加(Plt;0.05),而SLC711蛋白表达水平均无明显变化(Pgt;0.05)。<br> (9)自噬与CdCl2诱导的HepG2细胞死亡的关系:随着CdCl2浓度的增加,细胞中的自噬相关蛋白LC3A/B的表达水平也随之升高(Plt;0.05)。<br> (10)自噬抑制剂CQ对HepG2细胞活力以及氧化应激的影响:15μM的CQ预处理6h后,与单独CdCl2处理组相比,细胞的活力显著升高(Plt;0.05);细胞抗氧化指标SOD活力及GSH含量明显升高(Plt;0.05),氧化指标MDA及ROS含量降低(Plt;0.05)。<br> (11)自噬抑制剂CQ对HepG2细胞铁死亡指标的影响:CQ预处理后,细胞中Fe含量降低(Plt;0.05),GPX4蛋白表达水平增加(Plt;0.05),SLC711蛋白表达水平均无明显变化(Pgt;0.05)。<br> (12)自噬通过降解铁蛋白FTL促进铁死亡:随着CdCl2浓度的增加,细胞中铁轻链蛋白FTL的表达水平也随之降低(Plt;0.05)。CQ预处理后,铁轻链FTL蛋白表达水平增加(Plt;0.05)。<br> (13)内质网应激抑制剂GSK对CdCl2诱导的HepG2细胞自噬的影响:GSK预处理后,细胞中自噬蛋白LC3A/B的表达水平降低(Plt;0.05)。<br> (14)ROS抑制剂TEMPO对HepG2细胞活力以及氧化应激的影响:10μM的TEMPO预处理6h后,与单独CdCl2处理组相比,细胞的活力升高(Plt;0.05),抗氧化指标SOD活力及GSH含量明显升高(Plt;0.05),氧化指标MDA及ROS含量降低(Plt;0.05)。<br> (15)ROS抑制剂TEMPO对CdCl2诱导的HepG2细胞铁死亡相关指标的影响:TEMPO预处理后,细胞中Fe含量降低(Plt;0.05),GPX4蛋白表达水平增加(Plt;0.05),SLC711蛋白表达水平无明显变化(Pgt;0.05)。<br> (16)ROS与CdCl2诱导的HepG2细胞内质网应激以及自噬的关系:TEMPO预处理后,细胞中内质网应激蛋白GRP78和PERK的表达水平和自噬蛋白LC3A/B的表达水平降低(Plt;0.05),增加了铁轻链蛋白FTL的表达水平(Plt;0.05)。<br> 结论<br> 1.在一定染毒条件下,镉可致HepG2细胞发生氧化应激,表现为细胞抗氧化能力下降,氧化指标上升,造成肝细胞氧化损伤。<br> 2.在一定染毒条件下,镉可致HepG2细胞铁死亡相关指标发生变化,表现为Fe离子含量增加和GPX4mRNA和蛋白表达水平下降。<br> 3.在本研究条件下,镉可致HepG2细胞内质网应激蛋白、自噬以及活性氧(ROS)水平的升高。<br> 4.在本研究条件下,镉诱导的活性氧(ROS)可以诱导HepG2细胞内质网应激,随后触发下游自噬的启动,发生铁蛋白自噬,进而发生铁死亡。即ROS-内质网应激-自噬轴参与了镉诱导的肝细胞铁死亡。
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