检索历史 清除

摘要目的<br>　　氯化消毒是一种简单经济且高效的消毒方法，广泛应用于生活饮用水和游泳池等娱乐水体的消毒；在消毒过程中，含氯消毒剂与水中溶解性有机物作用产生氯化消毒副产物；其中，三氯甲烷的占比最高。三氯甲烷具有较强的挥发性，可通过皮肤、消化道或呼吸道进入机体内。三氯甲烷也是一种重要的有机合成原料；职业性低剂量三氯甲烷暴露引起的慢性中毒危害广泛存在。肝脏是三氯甲烷主要的代谢器官，绝大多数三氯甲烷中毒患者出现肝脏损害；但三氯甲烷对肝细胞的损害机制尚未充分阐明。氧化应激被认为是三氯甲烷致机体毒作用的重要机制之一。核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路可抵抗外界氧化和化学物质等刺激导致的氧化应激反应，是细胞拮抗氧化损伤的关键通路。然而，有关三氯甲烷对肝脏的氧化应激作用及对Nrf2信号通路的影响目前报道甚少。因此，本研究以人正常肝细胞L02细胞为研究对象，探讨Nrf2信号通路在三氯甲烷致L02细胞氧化损伤中的作用。进一步选择Nrf2激动剂tBHQ和抑制剂luteolin，将Nrf2信号因子单独上调或者下调，研究Nrf2信号通路对三氯甲烷致L02细胞氧化应激的调控机制，为揭示三氯甲烷的肝脏损害机制和预防三氯甲烷中毒提供实验证据。<br>　　方法<br>　　取人正常肝细胞L02进行体外培养实验；利用CCK-8法检测0、1、2、4、8、12、16、20 mM三氯甲烷染毒液处理24h和48h的L02细胞存活率；根据细胞存活率测定结果，取对数生长期L02细胞随机分为12组，每组设3个平行。第一组：对照组；第2-4组：三氯甲烷低、中、高剂量组；第5组：tBHQ试剂对照组；第6-8组：tBHQ+三氯甲烷低、中、高剂量组；第9组：luteolin试剂对照组；第10-12组：luteolin+三氯甲烷低、中、高剂量组。三氯甲烷的对照组和低、中、高剂量分别为0、4、8、12 mM。tBHQ预处理组：用50μM tBHQ预处理12h后，加入三氯甲烷染毒液处理24h；luteolin预处理组：用10μM luteolin预处理12h后，加入三氯甲烷染毒液处理24h。染毒结束后，收获细胞，以WST-1法检测L02细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力，可见光法检测L-02细胞中氧化应激指标过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，TBA法检测丙二醛（MDA）含量。实时荧光聚合酶链式反应法检测Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1)、醌氧化还原酶1（NQO1）和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC蛋白的表达。<br>　　结果<br>　　1. 三氯甲烷对L02细胞存活率的影响<br>　　随着三氯甲烷染毒浓度升高，L02细胞存活率出现下降的趋势。<br>　　2. 三氯甲烷对L02细胞氧化应激水平的影响<br>　　三氯甲烷染毒24h后，3个剂量组L02细胞SOD和GSH-Px活力均显著下降（均P＜0.05），MDA含量均显著升高（均P＜0.05），中剂量组和高剂量组L02细胞CAT活力显著下降（均P＜0.05）。<br>　　3. 三氯甲烷对L02细胞Nrf2信号通路的影响<br>　　三氯甲烷染毒24h后，高剂量组L02细胞Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；3个剂量组L02细胞NQO1和GCLC mRNA和蛋白表达水平均显著升高（均P＜0.05）。与对照组相比，3个剂量组L02细胞HO-1 mRNA表达水平均显著升高（均P＜0.05）；中剂量组L02细胞HO-1蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05）。<br>　　4. Nrf2信号因子上调后对三氯甲烷致L02细胞氧化应激的影响<br>　　与未经tBHQ预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比，tBHQ+高剂量组CAT活力显著升高（Plt;0.05），tBHQ+中、高剂量组SOD活力均显著升高（均Plt;0.05），tBHQ+低、中、高剂量组GSH-Px活力均显著升高（均Plt;0.05），tBHQ+中、高剂量组MDA含量均显著下降（均Plt;0.05）。<br>　　与未经tBHQ预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比，tBHQ+低、中、高剂量组Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC mRNA相对表达水平均显著升高（均Plt;0.05），tBHQ+低、中剂量组Nrf2蛋白相对表达水平均显著升高（均Plt;0.05），tBHQ+低、高剂量组HO-1蛋白相对表达水平均显著降低（均Plt;0.05），tBHQ+中、高剂量组NQO1蛋白相对表达水平均显著升高（均Plt;0.05），tBHQ+高剂量组GCLC蛋白相对表达水平显著降低（Plt;0.05）。<br>　　5. Nrf2信号因子下调后对三氯甲烷致L02细胞氧化应激的影响<br>　　与未经luteolin预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比，luteolin+低、中、高剂量组CAT活力均显著下降（均Plt;0.05），luteolin+中、高剂量组SOD活力均显著升高（均Plt;0.05），luteolin+低、中、高剂量组GSH-Px均显著升高（均Plt;0.05），luteolin+中、高剂量组MDA水平均显著下降（均Plt;0.05）。<br>　　与未经luteolin预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比，luteolin+中、高剂量组Nrf2 mRNA和蛋白相对表达水平均显著降低（均Plt;0.05）， luteolin+低、中、高剂量组HO-1、NQO1、GCLC mRNA和蛋白相对表达水平均显著降低（均Plt;0.05）。<br>　　结论<br>　　1. 一定浓度的三氯甲烷会抑制人正常肝细胞L02细胞的活性；降低细胞内抗氧化酶的活力，诱发氧化应激，造成氧化损伤；激活Nrf2信号通路，下游抗氧化酶HO-1、NQO1、GCLC的mRNA和蛋白相对表达水平升高。<br>　　2. 在本研究中，使用tBHQ上调Nrf2信号因子后，在三氯甲烷致L02细胞氧化应激中，Nrf2及其下游分子（HO-1、NQO1、GCLC）的mRNA和蛋白相对表达水平均升高，tBHQ处理显著减弱了三氯甲烷诱导的L02细胞氧化应激损伤。<br>　　3. 在本研究中，使用luteolin下调Nrf2信号因子后，在三氯甲烷致L02细胞氧化应激中，Nrf2及其下游分子（HO-1、NQO1、GCLC）的mRNA和蛋白相对表达水平均降低，luteolin处理加重了三氯甲烷诱导的L02细胞氧化应激损伤。