摘要目的<br> 氯化消毒是一种简单经济且高效的消毒方法,广泛应用于生活饮用水和游泳池等娱乐水体的消毒;在消毒过程中,含氯消毒剂与水中溶解性有机物作用产生氯化消毒副产物;其中,三氯甲烷的占比最高。三氯甲烷具有较强的挥发性,可通过皮肤、消化道或呼吸道进入机体内。三氯甲烷也是一种重要的有机合成原料;职业性低剂量三氯甲烷暴露引起的慢性中毒危害广泛存在。肝脏是三氯甲烷主要的代谢器官,绝大多数三氯甲烷中毒患者出现肝脏损害;但三氯甲烷对肝细胞的损害机制尚未充分阐明。氧化应激被认为是三氯甲烷致机体毒作用的重要机制之一。核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路可抵抗外界氧化和化学物质等刺激导致的氧化应激反应,是细胞拮抗氧化损伤的关键通路。然而,有关三氯甲烷对肝脏的氧化应激作用及对Nrf2信号通路的影响目前报道甚少。因此,本研究以人正常肝细胞L02细胞为研究对象,探讨Nrf2信号通路在三氯甲烷致L02细胞氧化损伤中的作用。进一步选择Nrf2激动剂tBHQ和抑制剂luteolin,将Nrf2信号因子单独上调或者下调,研究Nrf2信号通路对三氯甲烷致L02细胞氧化应激的调控机制,为揭示三氯甲烷的肝脏损害机制和预防三氯甲烷中毒提供实验证据。<br> 方法<br> 取人正常肝细胞L02进行体外培养实验;利用CCK-8法检测0、1、2、4、8、12、16、20 mM三氯甲烷染毒液处理24h和48h的L02细胞存活率;根据细胞存活率测定结果,取对数生长期L02细胞随机分为12组,每组设3个平行。第一组:对照组;第2-4组:三氯甲烷低、中、高剂量组;第5组:tBHQ试剂对照组;第6-8组:tBHQ+三氯甲烷低、中、高剂量组;第9组:luteolin试剂对照组;第10-12组:luteolin+三氯甲烷低、中、高剂量组。三氯甲烷的对照组和低、中、高剂量分别为0、4、8、12 mM。tBHQ预处理组:用50μM tBHQ预处理12h后,加入三氯甲烷染毒液处理24h;luteolin预处理组:用10μM luteolin预处理12h后,加入三氯甲烷染毒液处理24h。染毒结束后,收获细胞,以WST-1法检测L02细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力,可见光法检测L-02细胞中氧化应激指标过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,TBA法检测丙二醛(MDA)含量。实时荧光聚合酶链式反应法检测Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC蛋白的表达。<br> 结果<br> 1. 三氯甲烷对L02细胞存活率的影响<br> 随着三氯甲烷染毒浓度升高,L02细胞存活率出现下降的趋势。<br> 2. 三氯甲烷对L02细胞氧化应激水平的影响<br> 三氯甲烷染毒24h后,3个剂量组L02细胞SOD和GSH-Px活力均显著下降(均P<0.05),MDA含量均显著升高(均P<0.05),中剂量组和高剂量组L02细胞CAT活力显著下降(均P<0.05)。<br> 3. 三氯甲烷对L02细胞Nrf2信号通路的影响<br> 三氯甲烷染毒24h后,高剂量组L02细胞Nrf2 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);3个剂量组L02细胞NQO1和GCLC mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05)。与对照组相比,3个剂量组L02细胞HO-1 mRNA表达水平均显著升高(均P<0.05);中剂量组L02细胞HO-1蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。<br> 4. Nrf2信号因子上调后对三氯甲烷致L02细胞氧化应激的影响<br> 与未经tBHQ预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比,tBHQ+高剂量组CAT活力显著升高(Plt;0.05),tBHQ+中、高剂量组SOD活力均显著升高(均Plt;0.05),tBHQ+低、中、高剂量组GSH-Px活力均显著升高(均Plt;0.05),tBHQ+中、高剂量组MDA含量均显著下降(均Plt;0.05)。<br> 与未经tBHQ预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比,tBHQ+低、中、高剂量组Nrf2、HO-1、NQO1和GCLC mRNA相对表达水平均显著升高(均Plt;0.05),tBHQ+低、中剂量组Nrf2蛋白相对表达水平均显著升高(均Plt;0.05),tBHQ+低、高剂量组HO-1蛋白相对表达水平均显著降低(均Plt;0.05),tBHQ+中、高剂量组NQO1蛋白相对表达水平均显著升高(均Plt;0.05),tBHQ+高剂量组GCLC蛋白相对表达水平显著降低(Plt;0.05)。<br> 5. Nrf2信号因子下调后对三氯甲烷致L02细胞氧化应激的影响<br> 与未经luteolin预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比,luteolin+低、中、高剂量组CAT活力均显著下降(均Plt;0.05),luteolin+中、高剂量组SOD活力均显著升高(均Plt;0.05),luteolin+低、中、高剂量组GSH-Px均显著升高(均Plt;0.05),luteolin+中、高剂量组MDA水平均显著下降(均Plt;0.05)。<br> 与未经luteolin预处理的同剂量三氯甲烷单纯染毒组相比,luteolin+中、高剂量组Nrf2 mRNA和蛋白相对表达水平均显著降低(均Plt;0.05), luteolin+低、中、高剂量组HO-1、NQO1、GCLC mRNA和蛋白相对表达水平均显著降低(均Plt;0.05)。<br> 结论<br> 1. 一定浓度的三氯甲烷会抑制人正常肝细胞L02细胞的活性;降低细胞内抗氧化酶的活力,诱发氧化应激,造成氧化损伤;激活Nrf2信号通路,下游抗氧化酶HO-1、NQO1、GCLC的mRNA和蛋白相对表达水平升高。<br> 2. 在本研究中,使用tBHQ上调Nrf2信号因子后,在三氯甲烷致L02细胞氧化应激中,Nrf2及其下游分子(HO-1、NQO1、GCLC)的mRNA和蛋白相对表达水平均升高,tBHQ处理显著减弱了三氯甲烷诱导的L02细胞氧化应激损伤。<br> 3. 在本研究中,使用luteolin下调Nrf2信号因子后,在三氯甲烷致L02细胞氧化应激中,Nrf2及其下游分子(HO-1、NQO1、GCLC)的mRNA和蛋白相对表达水平均降低,luteolin处理加重了三氯甲烷诱导的L02细胞氧化应激损伤。
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