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摘要随着真菌感染日趋严重，急需研发新型、安全、高效的抗真菌感染药物。尽管放线菌次级代谢产物一直是抗真菌药物的主要来源，但传统以生物活性为导向的分离技术存在化合物重复分离和菌株生物合成潜力开发不足等问题。因此，通过基因组学和代谢组学来挖掘菌株的生物合成潜力，排除已知化合物，可以提高发现新结构先导化合物的效率。<br>　　课题组前期从蜚蠊肠道内分离一株放线菌WA1-19，具有良好的抗真菌活性，但抗菌物质基础不明。本文选择菌株WA1-19作为研究对象，利用形态学、分子生物学及构建系统发育树等方法对该菌株进行鉴定；利用琼脂扩散法测试菌株WA1-19发酵液及菌体部位粗提物的抗真菌活性；在此基础上，对菌株WA1-19进行基因组学与代谢组学分析，筛选有价值的抗真菌活性化合物，以供进一步研究；将抗白色念珠菌活性为评价指标，采用单因素优化法与响应面优化法筛选菌株最佳的发酵条件；采用化学分离方法分离菌株WA1-19的次级代谢产物，通过体外抗菌活性实验与转录组学分析对其生物活性及抗真菌机制进行初步研究。本文采用的主要研究方法与结果如下：<br>　　1、 菌株 WA1-19 生物学分类：通过菌落生长状态、革兰染色、扫描电镜观察菌株的形态学特征，利用16S rRNA序列同源性比对的分子生物学方法，构建系统发育树，菌株 WA1-19 被鉴定为Streptomyces sampsonii ，提交序列至 GenBank ，获得登录号为OK284408.1。<br>　　2、 菌株WA1-19抑菌谱测定：通过琼脂扩散法测定菌株WA1-19菌体粗提物对白色念珠菌、须癣毛癣菌、烟曲霉、黑曲霉均有抑菌活性，抑菌圈直径分别为17.5±0.27 mm、17.30±0.43 mm、13.00±1.22 mm、12.40±1.14 mm。<br>　　3、 菌株WA1-19基因组学与代谢组学分析：对菌株进行全基因组测序，得出此菌株基因组中含有21个次级代谢产物基因簇，其中基因簇14为Candicidin生物合成基因簇，与已知基因簇的同源性为96.62%。基于代谢组学的GNPS（Global Natural Products Social）分子网络结果显示， WA1-19 菌体甲醇提取物中可能含有 13 个Candicidin 类化合物分子。因此，推断菌株 WA1-19 具有合成多个Candicidin衍生物潜力。<br>　　4、 菌株WA1-19发酵条件优化：以白色念珠菌为指示菌，采用单因素优化法与响应面优化法确定菌株WA1-19最佳发酵条件。当在发酵时间为13 d、发酵培养基为RA、培养温度为28.5℃、接种量为5%、pH为7.1、载液量为214/500 mL时，WA1-19菌体提取物对白色念珠菌的抑制活性最强，抑菌圈直径为22.19±0.44 mm。<br>　　5、 菌株 WA1-19 次级代谢产物初步研究：在最优发酵条件下，对菌株WA1-19进行98 L大规模发酵。采用薄层层析法、硅胶柱层析、凝胶柱层析、分析型与半制备型高效液相色谱等方法对菌株的次级代谢产物进行分离纯化。从菌株WA1-19菌体粗提物中，通过GNPS分子网络、紫外吸收光谱结合质谱信息鉴定出 Candicidin A1、Candicidin A3与Candicidin D。通过核磁共振与质谱等波谱法结合数据库数据比对，从菌株 WA1-19 发酵液中分离鉴定出 N-（ 4-hydroxyphenethyl ） propionamide （ 1 ）、 N-（ 4-hydroxyphenethyl ） isobutyramide（2）、N-（4-hydroxyphenethyl）-2-phenylacetamide（3）、Cyclo（L-Tyr-L-Pro）（4）、N-acetyltyramine（5）、Nb-acetyltryptamine （6）等6个化合物。<br>　　6、 菌株WA1-19发酵液分离化合物的抗菌活性评价：分别测定从菌体发酵液分离得到6种化合物对白色念珠菌、须癣毛癣菌、烟曲霉、黑曲霉的抑菌活性。结果显示，化合物4具有较强的抗白色念珠菌活性，其MIC值为128μg/mL。<br>　　7、 Candicidin类化合物抗须癣毛癣菌作用机制研究：在浓度为64μg/mL的Candicidin类化合物作用须癣毛癣菌后，菌落大小与孢子数量显著减少、真菌细胞内核酸释放量明显增加、真菌细胞内活性氧ROS（Reactive Oxygen Species）水平明显提高、麦角甾醇含量显著降低。转录组数据表明，在GO（Gene Ontology）数据库注释中代谢过程、膜合成、细胞过程等显著富集，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）注释代谢通路主要包括碳代谢、氧化磷酸化、氨基酸的生物合成、糖酵解/糖异生等。表明 Candicidin 作用于须癣毛癣菌后，可能影响真菌细胞的能量代谢、蛋白质合成、酶的催化活性，进一步影响细胞膜结构完整性及氧化损伤机制从而发挥抗真菌作用。<br>　　综上所述，结合基因组学与代谢组学的GNPS分子网络策略预测蜚蠊肠道内生放线菌WA1-19具有合成Candicidin类化合物的潜力，从中鉴定出3个Candicidin类化合物，并通过转录组学对Candicidin类化合物的抗须癣毛癣菌作用机制进行初步研究。本研究利用基因组学与代谢组学相结合的方法，加速微生物天然产物发现效率，为进一步开发利用放线菌资源提供方法学借鉴。