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摘要三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)均为阴性的一类乳腺癌。和其他乳腺癌亚型相比，TNBC 约占所有乳腺癌患者的四分之一，因缺乏有效的治疗靶点导致其目前无有效的治疗策略。TNBC 还具有恶性程度较高、易转移以及预后较差等特点。值得注意的是， TNBC 具有显著的共同特征：高度依赖于有氧糖酵解，即Warburg effect。因此，抑制Warburg effect可能是TNBC 的有效治疗策略。糖酵解亚型在TNBC 中占比最高，且糖酵解是TNBC 细胞的主要供能方式，因此抑制TNBC 细胞的糖酵解似乎是治疗TNBC 的一种新思路。本课题研究了活性天然产物(+)-Miliusol 在TNBC 中的抗肿瘤活性及其作用机制。<br>　　目的：<br>　　1、从增殖、Warburg effect、迁移、凋亡以及自噬几个角度评价(+)-Miliusol 在TNBC 中的抗肿瘤活性及作用机制；2、探索(+)-Miliusol 诱导的自噬对于肿瘤增殖、Warburg effect 、迁移和凋亡的影响；3、探索(+)-Miliusol 体内抗肿瘤效果以及作用机制。<br>　　方法：<br>　　通过细胞活力检测以及细胞克隆形成实验探索(+)-Miliusol 对于TNBC 细胞的短期增殖和长期增殖的影响。此外通过葡萄糖摄取能力、乳酸生成量以及乳酸脱氢酶活力等实验检测(+)-Miliusol 对于TNBC 细胞Warburg effect的影响。其次，进一步通过免疫荧光、Western blot 等实验方法验证(+)-Miliusol 对TNBC 细胞迁移、凋亡和自噬的影响。接下来通过使用自噬抑制剂来验证(+)-Miliusol 诱导的自噬对于其调控的细胞增殖、Warburg effect、迁移和凋亡的影响。最后通过斑马鱼异种移植模型和裸鼠异种移植瘤模型进一步评价(+)-Miliusol 在体内的抗肿瘤效果以及作用机制。<br>　　结果：<br>　　1、(+)-Miliusol 抗TNBC 的作用机制研究：首先通过细胞活力检测和细胞克隆形成实验证明了(+)-Miliusol 抑制TNBC 细胞的短期增殖和长期增殖。其次通过(+)-Miliusol 处理后BT-549 和MDA-MB-231 细胞的增殖标志物Ki-67 的表达，进一步验证(+)-Miliusol 的抗增殖活性。接下来通过葡萄糖摄取能力、乳酸生成量以及乳酸脱氢酶活力等实验证(+)-Miliusol 对于BT-549 和MDA-MB-231 细胞Warburg effect 的抑制作用。同时也通过Western blot、免疫荧光检测关键糖酵解调节因子乳酸脱氢酶A (lactateamp;nbsp;dehydrogenase A, LDHA) 等蛋白的表达，进一步证明了(+)-Miliusol 抑制BT-549 和MDA-MB-231 细胞的Warburg effect。由于TNBC 易转移的特点，接下来通过细胞划痕实验、Transwell 实验验证了(+)-Miliusol 对细胞迁移的影响，同时也通过检测转移标志物MMP-2 (Matrix Metallopeptidase 2)、E-cadherin 的表达证明了(+)-Miliusol 对BT-549和MDA-MB-231 细胞迁移的抑制作用。其次，通过对凋亡以及自噬关键蛋白的检测验证(+)-Miliusol 诱导BT-549 和MDA-MB-231 细胞发生凋亡以及自噬。<br>　　2、(+)-Miliusol 诱导的自噬对于TNBC 细胞抗肿瘤活性及其作用机制的影响：通过使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)和氯喹(Chloroquine, CQ)来进一步探索(+)-Miliusol 诱导的自噬对BT-549 和MDA-MB-231细胞的增殖、Warburg effect、迁移以及凋亡的影响。首先通过MTT 实验以及细胞克隆形成实验验证了3-MA 和CQ 对自噬的抑制对于(+)-Miliusol 抑制BT-549 和MDA-MB-231 细胞的短期增殖没有显著影响，但3-MA 和CQ 对自噬的抑制促进了(+)-Miliusol 抑制MDA-MB-231 细胞长期增殖的能力。其次探索了(+)-Miliusol 诱导的自噬对BT-549 和MDA-MB-231 细胞Warburg effect 的影响，实验结果表明自噬抑制剂3-MA 和CQ 对于BT-549 和MDA-MB-231 细胞的乳酸生成量以及乳酸脱氢酶活性的影响略有不同。自噬抑制剂3-MA 和CQ 对于BT-549 和MDA-MB-231细胞的Warburg effect 的影响可能主要通过调节葡萄糖摄取能力来实现。接下来，进一步探索了3-MA 和CQ 抑制自噬对于(+)-Miliusol 调控的迁移和凋亡的影响。实验结果进一步表明了(+)-Miliusol 诱导的自噬促进了BT-549 和MDA-MB-231 细胞的迁移，并抑制了TNBC 细胞的凋亡。<br>　　3、(+)-Miliusol 体内抗TNBC 的活性及作用机制研究：首先通过斑马鱼异种移植模型考察(+)-Miliusol 的体内抗肿瘤活性，实验结果证明(+)-Miliusol 具有较好的抗增殖和抑制转移效果。其次，通过裸鼠异种移植瘤模型探索(+)-Miliusol 的抗肿瘤潜力以及作用机制。通过对肿瘤生长速度、肿瘤体积以及免疫组化等实验结果分析得知，(+)-Miliusol在裸鼠异种移植瘤模型中仍具有良好的抗肿瘤效果。但是自噬抑制剂CQ 对(+)-Miliusol抑制肿瘤增长速度以及肿瘤体积没有显著影响，对Warburg effect、凋亡、自噬以及迁移等一些标志物蛋白的表达有不同的影响，但总体来说，自噬抑制剂CQ 对肿瘤表型的影响不大。<br>　　结论：<br>　　综上所述，(+)-Miliusol 能显著抑制TNBC 细胞的增殖、Warburg effect、迁移，并显著诱导自噬和凋亡。并且进一步验证了(+)-Miliusol 诱导的自噬参与了其对Warburg effect、迁移和凋亡的调节，但对细胞增殖的影响不明显，可能是由于作用时间的影响。同时通过斑马鱼异种移植模型以及裸鼠异种移植瘤模型在体内评价了(+)-Miliusol 的抗肿瘤潜力。本课题为TNBC 的精准治疗提供了一个新的天然活性候选化合物，未来有希望成为TNBC 的潜在候选药物。