检索历史 清除

摘要去泛素化酶家族在多种动物中调控细胞增殖、分化、凋亡，参与肿瘤的发生发展。其中泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin specific proteases, USP7）可介导底物蛋白质去泛素化，阻止靶蛋白被过度降解，是癌症潜在的治疗靶点。日本三角涡虫（Dugesia japonica）作为研究再生和神经发育的理想模式动物，具有强大的再生能力。目前研究表明泛素化对维持涡虫整体稳态，调控细胞周期和促进再生有重要作用，但去泛素化在涡虫再生的作用鲜有报道，USP7在涡虫中的功能仍不清楚。Cullin1是泛素连接酶复合体的骨架蛋白，使TGF-β信号通路中Smad2/3被泛素化降解，抑制TGF-β信号通路，Tinp1是TGF-β信号通路的下游分子，二者都与细胞周期密切相关。本研究在前期研究的基础上，从Djcullin1 RNAi和 Djtinp1 RNAi的转录组数据，筛选出 Djusp7基因，利用 RNA interference（RNAi）、实时荧光定量PCR（qPCR）、免疫荧光、原位杂交及X射线辐照等实验技术探究Djusp7在涡虫再生过程中的功能。实验结果如下：<br>　　(1)Djcullin1 RNAi和Djtinp1 RNAi的转录组数据差异表达基因前五项都与细胞膜、核糖体、吞噬体和内质网等细胞器对蛋白质的合成转运降解过程和信号转导相关，且两基因干扰后存在3818个相同变化的基因。<br>　　(2)Djusp7 RNAi后，整体涡虫形态和神经系统没有变化；涡虫头、中、尾片段，前端伤口可以再生头或咽，但后端伤口无法再生缺失组织，而且头片段还出现黑色条斑；涡虫头片段和中间片段腹神经索呈现钝圆状闭合，中间片段和尾片段再生的头神经节小。H3P免疫荧光实验统计结果显示，中间片段再生过程细胞增殖水平显著降低。TUNEL细胞凋亡实验结果显示，再生3h中间片段细胞凋亡水平显著升高。<br>　　(3)Djusp7 RNAi后，再生7 d中间片段qPCR实验结果显示，眼点标记基因Djovo、肠标记基因Djgat、细胞周期相关基因DjcyclinB表达水平显著升高，神经标记基因Djpc2和Djchat、细胞凋亡相关基因Djcasepase8表达水平显著降低，Djcasepase3没有变化，干细胞标记基因没有明显变化。<br>　　(4)Djusp7 RNAi后，qPCR实验结果显示再生3 d和7 d，Wnt信号通路基因表达水平显著降低。原位杂交结果显示再生3 d，Djwnt1无法在伤口后端聚集表达，Djwnt11-2表达被抑制，Djβ-catenin-1在两端芽基的表达减弱。X射线辐照消除正常涡虫干细胞后，整体涡虫Djusp7表达水平显著升高，Djwnt1表达水平无变化，再生3 d，Djusp7和Djwnt1的表达水平显著降低，并且Djwnt1不能正常形成点状聚集信号。<br>　　(5)单独抑制Wnt信号通路不同基因（Djwnt-1、Djwnt-11-2和Djβ-catenin-1）后，涡虫再生无尾， Djwnt1 RNAi和 Djwnt11-2 RNAi， Djusp7的表达均显著升高，但Djβ-catenin-1 RNAi后涡虫Djusp7的表达显著降低。<br>　　(6)为进一步了解Djusp7在日本三角涡虫中的功能，检测了Djusp7 RNAi后再生过程TGF-β信号通路相关基因和高等动物USP7底物的同源基因的表达。再生5 d中间片段Djactivin、Djsmurf、Djsmad2、Djsmad4-1、Djp53、Djyki、Djpten和Djfoxo表达水平均升高；再生7 d，Djfoxo、Djpten和TGF-β信号通路基因表达水平升高。<br>　　综上所述，Djusp7在日本三角涡虫再生过程调控细胞周期，促进芽基形成、组织再生和神经系统发育，通过调控Wnt信号通路促进身体前后轴极性的重建，Djusp7与Wnt信号通路有复杂的联系。本研究提示去泛素化过程对涡虫再生过程位置信息重建，神经系统发育，细胞增殖和凋亡具有重要作用，研究结果为解析USP7的功能及涡虫再生机制提供基础数据。