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摘要近年来RNA病毒导致的人兽共患病肆虐横行，威胁动物和人类健康。因共性候选靶标分子的缺乏制约了广谱抗RNA病毒药物的研发。RNA病毒感染时，宿主的模式识别受体视黄酸诱导基因Ⅰ（Retinoic-acid-induciblegeneⅠ,RIG-Ⅰ）识别病毒核酸，激活下游接头蛋白MAVS、TBK1等一系列信号分子，导致分泌Ⅰ型干扰素（TypeⅠinterferon,IFN-Ⅰ）抑制病毒复制。IFN-Ⅰ是广谱抗病毒分子，宿主或病毒分别通过调控该通路的关键节点分子的表达或活性调控IFN-Ⅰ信号反应。探究调控IFN-Ⅰ的宿主因子，将为研发广谱抗病毒药物提供参考和依据。<br>　　CD97（Clusterofdifferentiation97,CD97）是一种粘附型G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors,GPCRs），GPCRs参与许多生理和病理过程，已成为新药研发的重要靶标分子。本实验室前期通过牛副流感病毒3型（Bovineparainfluenzavirus3,BPIV3）感染宿主细胞，转录组测序筛选到转录上调的CD97基因，进一步发现CD97促进BPIV3复制，然而CD97在水疱性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus,VSV）等其他RNA病毒复制中的功能，尚不清楚。深入研究GPCRs与IFN-Ⅰ信号通路的调控关系，或许能够为病毒性疾病的治疗提供新的视角。本研究对CD97在RNA病毒诱导的IFN-Ⅰ信号反应中的功能与机制进行探讨，主要实验结果如下：<br>　　（1）CD97促进VSV、SARS-CoV-2和H1N1的体外复制<br>　　为研究CD97对RNA病毒复制的影响，我们选择了有代表性的RNA病毒：单股负链RNA病毒VSV和甲型H1N1流感病毒（InfluenzaAH1N1,H1N1）以及单股正链RNA病毒严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2），进行了研究。首先建立了过表达或敲除/敲低CD97的HeLa、Caco-2和A549细胞系，通过Westernblot和流式细胞术进行了验证。分别使用VSV感染HeLa细胞、SARS-CoV-2感染Caco-2细胞和H1N1感染A549细胞，不同感染时间点收集细胞，通过RT-qPCR、Westernblot和TCID50检测病毒基因转录、蛋白表达和病毒滴度的变化。结果显示过表达CD97促进VSV、SARS-CoV-2和H1N1复制，敲除/敲低CD97抑制病毒复制。分别提取CD97基因敲除和野生型C57BL/6J小鼠的原代腹腔巨噬细胞，使用VSV和SARS-CoV-2感染，RT-qPCR和TCID50检测病毒复制，结果显示CD97基因敲除抑制病毒在原代巨噬细胞中的复制。使用小分子药物血根碱处理病毒感染的细胞，通过上述方法检测CD97的蛋白表达及病毒复制。结果显示血根碱抑制CD97的表达，并抑制VSV、SARS-CoV-2和H1N1的复制。这些结果表明，CD97促进VSV、SARS-CoV-2和H1N1的体外复制。<br>　　（2）CD97通过抑制RIG-Ⅰ负调控IFN-Ⅰ信号反应<br>　　为研究CD97是否通过影响IFN-Ⅰ信号反应促进病毒复制，使用IFN-β和干扰素刺激反应元件（InterferonStimulatedResponseElement,ISRE）启动子质粒与CD97质粒共同转染HEK-293T细胞，VSV和Poly（I:C）刺激12h，双荧光素酶报告基因实验结果显示CD97抑制IFN-β和ISRE启动子活性。使用病毒感染过表达或敲除CD97的细胞，RT-qPCR检测CD97对IFN的转录水平的影响，发现CD97抑制IFN-β和干扰素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes,ISGs）的mRNA转录；Westernblot检测CD97对IFN-Ⅰ信号通路相关蛋白的影响，发现CD97抑制IRF3和TBK1的磷酸化。分别提取CD97基因敲除及野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞和骨髓巨噬细胞，VSV和Poly（I:C）刺激后检测IFN-Ⅰ的变化，得到与传代细胞一致的结果。通过免疫共沉淀检测与CD97相互作用的IFN-Ⅰ信号通路接头蛋白，发现CD97与RIG-Ⅰ存在相互作用。双荧光素酶报告基因实验结果显示CD97抑制RIG-Ⅰ诱导的IFN-β和ISRE启动子活性。最后，Westernblot实验结果显示VSV、SARS-CoV-2和H1N1感染时，CD97均能抑制RIG-Ⅰ的表达。这些结果表明，CD97通过抑制RIG-Ⅰ负调控IFN-Ⅰ信号反应。<br>　　（3）CD97通过RNF125降解RIG-Ⅰ抑制IFN-Ⅰ信号反应<br>　　为揭示CD97对RIG-Ⅰ的降解机制，使用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体抑制剂氯喹（CQ）处理过表达CD97的细胞，Westernblot结果显示在病毒感染时，MG132抑制CD97对RIG-Ⅰ的降解。通过CHX追踪实验发现敲除CD97抑制RIG-Ⅰ的降解，RT-qPCR结果显示CD97不影响RIG-Ⅰ的mRNA转录，以上表明CD97通过蛋白酶体途径降解RIG-Ⅰ。通过转染RIG-Ⅰ和泛素分子相应的质粒，免疫共沉淀检测RIG-Ⅰ的泛素化，发现CD97促进RIG-Ⅰ泛素化，且特异地增强RIG-Ⅰ发生赖氨酸48位连接的泛素化。为探究CD97降解RIG-Ⅰ的机制，通过转录组测序技术筛选到CD97调控RIG-Ⅰ降解的E3泛素连接酶RNF125，实验结果显示过表达CD97促进RNF125的表达。进一步通过免疫共沉淀验证了CD97与RNF125之间存在相互作用，免疫荧光验证它们之间存在共定位，且CD97的C末端与RNF125互作，而RNF125的N末端与CD97互作。将RNF125酶活性位点突变，发现与野生型RNF125相比，RNF125酶失活突变体不能与CD97协同降解RIG-Ⅰ，在CD97过表达细胞系中沉默RNF125则阻断其对RIG-Ⅰ的降解，说明CD97对RIG-Ⅰ的降解依赖于RNF125。泛素化实验进一步揭示了CD97和RNF125协同促进RIG-Ⅰ的泛素化，而在过表达CD97的细胞中沉默RNF125不能促进RIG-Ⅰ的泛素化。将RIG-Ⅰ的部分赖氨酸位点进行突变，发现CD97对RIG-Ⅰ的181位赖氨酸突变体影响不显著，也不能抑制其诱导的IFN-β启动子活性，表明RIG-Ⅰ的181位赖氨酸是CD97降解RIG-Ⅰ、抑制IFN-Ⅰ的关键位点。这些结果表明，CD97通过RNF125降解RIG-Ⅰ抑制IFN-Ⅰ信号反应。<br>　　（4）CD97基因敲除增强小鼠对病毒的抵御<br>　　为研究CD97在体内对病毒复制的功能，使用CD97基因敲除小鼠和对应的野生型C57BL/6J小鼠进行研究。分别经腹腔注射VSV、鼻吸接毒SARS-CoV-2和H1N1，不同时间点取小鼠组织，经研磨后通过RT-qPCR和TCID50检测病毒复制。结果显示，与野生型小鼠相比，CD97基因敲除小鼠的脾、肺、肝和鼻甲中的病毒复制减少。小鼠组织进一步通过RT-qPCR和ELISA检测IFN-Ⅰ信号反应，发现CD97基因敲除小鼠脏器中的IFN-Ⅰ表达显著高于野生型小鼠。VSV感染的肺组织经石蜡切片和Hamp;E染色检测病理变化，发现与野生型小鼠相比，CD97基因敲除小鼠的肺组织病理变化显著减弱。不同感染剂量的VSV和H1N1接种小鼠检测体重和存活率的变化，发现CD97基因敲除促进小鼠体重恢复、降低小鼠死亡率，表明CD97基因敲除通过增强小鼠IFN-Ⅰ的产生、抑制VSV等RNA病毒复制，抵御病毒感染。这些结果表明，CD97基因敲除增强小鼠对病毒的抵御。<br>　　综上所述，本研究阐明了CD97通过RNF125降解RIG-Ⅰ负调控IFN-Ⅰ信号反应促进RNA病毒复制的分子机制。通过体内实验证明CD97基因敲除促进小鼠IFN-Ⅰ的产生、抑制小鼠体内的病毒复制，进而降低病毒感染引起的病理变化，增加小鼠存活率。本研究首次揭示了宿主因子CD97抑制IFN-Ⅰ信号反应促进病毒复制的分子机制，为广谱抗病毒药物研究提供了候选靶标分子，丰富了宿主蛋白调控天然免疫的理论知识。