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摘要利福霉素，作为治疗结核病的一线药物，其合成由43个基因组成的rif基因簇负责，从rifS到rifZ。前期研究发现RifZ可以与rif基因簇中六个启动子区域结合，包括rifA的启动子，从而能够直接激活了大多数的rif基因的表达，是rif基因簇的途径特异性转录调控因子，而氮代谢全局调控蛋白GlnR能特异性地与rifZ 上游启动子区域结合，进而正调控 rif 基因簇的表达。那么是否还有其他全局性或多效性调控蛋白参与调控rif基因簇的表达目前是未知的。<br>　　因此，本论文的第一部分是采用 DNA亲和捕获技术（DACA）结合蛋白质质谱技术（LC-MS/MS），从地中海拟无枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）粗蛋白中筛选和验证利福霉素生物合成基因簇（rif）中 rifA 启动子区域对应的结合蛋白。鉴于在培养基中添加 80 mM 硝酸盐对利福霉素产量有明显的促进作用，选取了在添加硝酸盐和不添加硝酸盐的条件下通过 DACA 捕获结合蛋白，并通过 LC-MS/MS 鉴定捕获的蛋白序列。随后基于蛋白保守结构域分析，从中挑选出13个含有HTH结构域的蛋白，通过EMSA分析发现AMED_8583（GntR家族调控蛋白）可以特异性结合rifA启动子区域。该发现为后续深入研究rif基因簇的调控奠定了基础。<br>　　随着利福霉素的应用，发现在很多致病菌或非致病菌中存在多种抗性机制，例如利福霉素失活酶或其作用靶标RpoB的突变介导的抗性。其中利福霉素失活酶编码的基因（例如，arr、rox、rgt、rph）启动子区域广泛存在一个保守的对利福霉素响应的反向回文序列（RAE），但目前对于识别 RAE的结合蛋白及其调控机制仍不清楚。因此，在本论文的第二部分中，我们同样采用 DACA 结合LC-MS/MS技术捕获了耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中利福霉素失活酶基因 arr启动子的结合蛋白。首先通过 qRT-PCR确认在利福霉素的诱导下arr基因转录水平显著提高的取样时间点（诱导3 h），随后通过DACA结合LC-MS/MS获得了38个疑似特异结合arr启动子的蛋白，对这些蛋白进行保守结构域分析，并对其中 10 个含有 HTH 结构域的蛋白进行异源表达与纯化，最后，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）发现，MSMEG_2211 和 MSMEG_1930 对arr 探针具有特异性结合能力，并且其编码基因的转录水平在利福霉素诱导条件下也明显提高。这些结果暗示MSMEG_2211和MSMEG_1930能够特异结合arr启动子区，并调控下游基因的转录。<br>　　最后，在本论文的第三部分中，通过对放线菌糖异生关键基因 pckA启动子中 GlnR结合位点进行点突变分析验证了前期鉴定的 GlnR结合位点的正确性和保守性。本实验室前期通过 EMSA 和 DNase I footprinting 预测了地中海拟无枝酸菌、耻垢分枝杆菌和天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）pckA 启动子区域中GlnR蛋白的识别位点，但是未经过突变分析验证。本论文通过突变地中海拟无枝酸菌pckA启动子中预测的3个GlnR结合位点、耻垢分枝杆菌pckA启动子中预测的2个位点以及天蓝色链霉菌pckA启动子中预测的3个位点，并结合EMSA分析确认了前期预测的GlnR蛋白的结合位点的正确性。这个结果不仅说明了 GlnR结合位点具有比较好的保守性，而且暗示了 GlnR对于协调碳氮代谢发挥着重要作用。<br>　　综上所述，本论文前两部分工作通过DACA与LC-MS/MS技术，成功捕获到了利福霉素合成基因 rifA 启动子区域的特异性结合蛋白 AMED_8583 以及利福霉素失活酶基因 arr 启动子区域的特异性结合蛋白 MSMEG_2211 和MSMEG_1930，为进一步解析隐含其中的调控机制奠定了坚实基础。在第三部分工作中，通过对三株放线菌中糖异生关键基因 pckA启动子中 GlnR结合位点的突变分析确认了前期预测的 GlnR 结合位点的正确性，这个发现不仅说明了GlnR 结合位点具有比较好的保守性，并且进一步强调了 GlnR 对于放线菌碳氮代谢的平衡性发挥着重要作用。