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摘要【目的】<br>　　1、探讨下丘脑室旁核CRH神经元介导PICS小鼠脾脏T淋巴细胞功能的机制研究。<br>　　2、研究脾脏交感神经释放去甲肾上腺素对T淋巴细胞功能的影响<br>　　3、研究下丘脑室旁核CRH神经元活性对PICS小鼠继发性感染死亡率的影响<br>　　【方法】<br>　　1、将6-8周雄性小鼠C57BL/6J，体重约为22g，分为两组：假手术组（SHAM组）和脓毒症免疫抑制组(PICS组),小鼠通过腹腔注射戊巴比妥(75mg/kg)麻醉，用电热垫保暖，备皮，沿腹中线开腹，长度约1.0cm，盲肠结扎穿刺，缝合，保暖。建立模型8天后，腹腔注射内毒素（LPS,10mg/kg），绘制生存曲线分析存活率；流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞的激活标志物CD69以及免疫细胞的比例变化；脾脏组织切片HE染色检测脾脏损伤程度，ELISA试剂盒检测脾脏去甲肾上腺素水平。<br>　　2、将6周小鼠通过腹腔注射戊巴比妥(100mg/kg)麻醉，用电热垫保暖，并安装在立体定向装置上以平行于参考面板调整头骨。使用微量注射泵，将AAV腺病毒（DIO-EYFP,DIO-hM4D(Gi)）缓慢注射(20nl/min)到PVN(Bregma坐标:?0.6mmAP，±0.2mmML，?4.8mmDV)。待AAV腺病毒表达21天后造PICS模型。通过腹腔注射CNO（1mg/kg）操控下丘脑室旁核的CRH神经元，并通过腹腔注射内毒素（LPS,10mg/kg）模拟临床继发性感染，绘制生存曲线分析存活率；流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞的激活标志物CD69以及免疫细胞的比例变化；QPCR检测T淋巴细胞炎症因子IFN-γ的表达，脾脏组织切片HE染色检测脾脏损伤程度，ELISA试剂盒检测脾脏去甲肾上腺素水平。<br>　　3、4周小鼠构建脾脏去神经化模型，小鼠休息恢复4周后，构建PICS模型，流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞的激活标志物CD69以及免疫细胞的比例变化，脾脏组织切片HE染色检测脾脏损伤程度，ELISA试剂盒检测脾脏去甲肾上腺素水平。<br>　　4、PBS和4%多聚甲醛全身灌流，剥取小鼠脑袋，30%蔗糖脱水，OCT包埋后使用冰冻切片机切片，注射位点荧光成像（40um），免疫荧光染色（40um），原位杂交（14um）。<br>　　5、脾脏注射PRV病毒逆行示踪，冰冻切片切全脑成像。<br>　　【结果】<br>　　1、PICS小鼠继发性感染的存活率：假手术组小鼠与PICS小鼠分别腹腔注射LPS（10mg/kg），统计小鼠的存活个数，进行生存曲线分析。结果显示，与假手术组小鼠相比，PICS小鼠接受LPS打击后，生存率显著下降。<br>　　2、PICS小鼠脾脏T淋巴细胞减少且呈免疫低反应性：与假手术小鼠相比，PICS小鼠脾脏T淋巴细胞比例明显下降（P＜0.05），并且T淋巴细胞对内毒素刺激的响应程度显著降低（P＜0.05），这表明PICS小鼠脾脏T淋巴细胞数量降低且功能下降。此外，脾脏组织切片HE染色显示，PICS小鼠脾脏比假手术组的损坏程度更大。<br>　　3、下丘脑室旁核表达的CRH神经元在PICS模型兴奋：PICS小鼠全脑c-fos染色结果提示，下丘脑室旁核的神经元兴奋；脾脏注射PRV逆行示踪结果表明下丘脑室旁核与脾脏存在解剖连接，原位杂交结果表明主要是CRH神经元投射到脾脏。<br>　　4、抑制下丘脑室旁核CRH神经元改善脾脏T淋巴细胞功能：利用化学遗传学技术，脑立体定位注射AAV腺病毒抑制下丘脑室旁核CRH神经元，PICS小鼠继发性感染的生存率提高，脾脏T淋巴细胞的数量和功能有所改善（P＜0.05），以及脾脏组织切片HE染色结果提示，抑制下丘脑室旁核CRH神经元后，PICS小鼠脾脏的损伤程度减轻。<br>　　5、PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素增多：ELISA检测发现，PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素水平升高（P＜0.05），且抑制下丘脑室旁核CRH神经元后PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素水平降低（P＜0.05）。此外，去甲肾上腺素水平的增高会影响T淋巴细胞的数量及功能，并且可能是通过β2-肾上腺素能受体发挥作用。<br>　　【结论】<br>　　1、抑制PICS小鼠下丘脑室旁核CRH神经元降低了继发性感染小鼠的存活率。<br>　　2、抑制PICS小鼠下丘脑室旁核CRH神经元改善脾脏T淋巴细胞的功能<br>　　3、PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素增多并抑制T淋巴细胞的功能。