摘要【目的】<br> 1、探讨下丘脑室旁核CRH神经元介导PICS小鼠脾脏T淋巴细胞功能的机制研究。<br> 2、研究脾脏交感神经释放去甲肾上腺素对T淋巴细胞功能的影响<br> 3、研究下丘脑室旁核CRH神经元活性对PICS小鼠继发性感染死亡率的影响<br> 【方法】<br> 1、将6-8周雄性小鼠C57BL/6J,体重约为22g,分为两组:假手术组(SHAM组)和脓毒症免疫抑制组(PICS组),小鼠通过腹腔注射戊巴比妥(75mg/kg)麻醉,用电热垫保暖,备皮,沿腹中线开腹,长度约1.0cm,盲肠结扎穿刺,缝合,保暖。建立模型8天后,腹腔注射内毒素(LPS,10mg/kg),绘制生存曲线分析存活率;流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞的激活标志物CD69以及免疫细胞的比例变化;脾脏组织切片HE染色检测脾脏损伤程度,ELISA试剂盒检测脾脏去甲肾上腺素水平。<br> 2、将6周小鼠通过腹腔注射戊巴比妥(100mg/kg)麻醉,用电热垫保暖,并安装在立体定向装置上以平行于参考面板调整头骨。使用微量注射泵,将AAV腺病毒(DIO-EYFP,DIO-hM4D(Gi))缓慢注射(20nl/min)到PVN(Bregma坐标:?0.6mmAP,±0.2mmML,?4.8mmDV)。待AAV腺病毒表达21天后造PICS模型。通过腹腔注射CNO(1mg/kg)操控下丘脑室旁核的CRH神经元,并通过腹腔注射内毒素(LPS,10mg/kg)模拟临床继发性感染,绘制生存曲线分析存活率;流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞的激活标志物CD69以及免疫细胞的比例变化;QPCR检测T淋巴细胞炎症因子IFN-γ的表达,脾脏组织切片HE染色检测脾脏损伤程度,ELISA试剂盒检测脾脏去甲肾上腺素水平。<br> 3、4周小鼠构建脾脏去神经化模型,小鼠休息恢复4周后,构建PICS模型,流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞的激活标志物CD69以及免疫细胞的比例变化,脾脏组织切片HE染色检测脾脏损伤程度,ELISA试剂盒检测脾脏去甲肾上腺素水平。<br> 4、PBS和4%多聚甲醛全身灌流,剥取小鼠脑袋,30%蔗糖脱水,OCT包埋后使用冰冻切片机切片,注射位点荧光成像(40um),免疫荧光染色(40um),原位杂交(14um)。<br> 5、脾脏注射PRV病毒逆行示踪,冰冻切片切全脑成像。<br> 【结果】<br> 1、PICS小鼠继发性感染的存活率:假手术组小鼠与PICS小鼠分别腹腔注射LPS(10mg/kg),统计小鼠的存活个数,进行生存曲线分析。结果显示,与假手术组小鼠相比,PICS小鼠接受LPS打击后,生存率显著下降。<br> 2、PICS小鼠脾脏T淋巴细胞减少且呈免疫低反应性:与假手术小鼠相比,PICS小鼠脾脏T淋巴细胞比例明显下降(P<0.05),并且T淋巴细胞对内毒素刺激的响应程度显著降低(P<0.05),这表明PICS小鼠脾脏T淋巴细胞数量降低且功能下降。此外,脾脏组织切片HE染色显示,PICS小鼠脾脏比假手术组的损坏程度更大。<br> 3、下丘脑室旁核表达的CRH神经元在PICS模型兴奋:PICS小鼠全脑c-fos染色结果提示,下丘脑室旁核的神经元兴奋;脾脏注射PRV逆行示踪结果表明下丘脑室旁核与脾脏存在解剖连接,原位杂交结果表明主要是CRH神经元投射到脾脏。<br> 4、抑制下丘脑室旁核CRH神经元改善脾脏T淋巴细胞功能:利用化学遗传学技术,脑立体定位注射AAV腺病毒抑制下丘脑室旁核CRH神经元,PICS小鼠继发性感染的生存率提高,脾脏T淋巴细胞的数量和功能有所改善(P<0.05),以及脾脏组织切片HE染色结果提示,抑制下丘脑室旁核CRH神经元后,PICS小鼠脾脏的损伤程度减轻。<br> 5、PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素增多:ELISA检测发现,PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素水平升高(P<0.05),且抑制下丘脑室旁核CRH神经元后PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素水平降低(P<0.05)。此外,去甲肾上腺素水平的增高会影响T淋巴细胞的数量及功能,并且可能是通过β2-肾上腺素能受体发挥作用。<br> 【结论】<br> 1、抑制PICS小鼠下丘脑室旁核CRH神经元降低了继发性感染小鼠的存活率。<br> 2、抑制PICS小鼠下丘脑室旁核CRH神经元改善脾脏T淋巴细胞的功能<br> 3、PICS小鼠脾脏去甲肾上腺素增多并抑制T淋巴细胞的功能。
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