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摘要目的：<br>　　巨噬细胞在结核分枝杆菌感染过程中不仅扮演着抗结核免疫的关键角色，同时也作为结核分枝杆菌的隐匿地。外泌体内含丰富的核酸、蛋白质和脂质等重要的生物分子，通过其释放和摄取，在细胞间传递信息，达到细胞间沟通的作用。课题组前期研究发现，感染结核分枝杆菌的巨噬细胞能够抑制巨噬细胞对结核菌的杀伤作用，而且这种抑制效应在使用外泌体抑制剂后消失。测序结果显示，感染结核分枝杆菌的巨噬细胞外泌体中miR-146a-5p水平显著上调。本研究在课题组前期工作的基础上，探究结核分枝杆菌感染巨噬细胞外泌体与受体细胞炎症细胞因子分泌及杀菌活性之间的联系，并探讨miR-146a-5p在结核分枝杆菌感染巨噬细胞外泌体中的表达水平以及作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.建立高效的细胞外泌体以及血浆外泌体提取技术，根据纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白免疫印迹法（WB）验证提取的外泌体是否符合国际细胞外囊泡标准，确保获得纯度高且一致性良好的外泌体样本。<br>　　2.利用Transwell共培养试验和外泌体孵育试验，评估感染前后巨噬细胞分泌的外泌体对受体巨噬细胞细胞因子分泌的影响。<br>　　3.对巨噬细胞释放的外泌体进行microRNA测序分析，随后进行基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，通过生物信息学筛选出可能参与下游免疫调节机制的关键分子。<br>　　4.通过real-time PCR，检测关键分子在细胞释放的外泌体和血浆外泌体中的表达水平。同时，利用从 NCBI GEO 数据库下载的基因表达谱 GSE116542 数据对这些关键分子的表达水平进行进一步的验证和分析。<br>　　5.挑选感染后外泌体中表达水平较高的关键分子，在细胞中转染抑制剂，并利用real-time PCR验证转染后关键分子在细胞内以及受体细胞中的表达水平。<br>　　6.利用Transwell共培养试验和外泌体孵育试验，探讨在回复试验中关键分子对细胞炎症因子的分泌、杀菌活性以及下游机制。<br>　　结果：<br>　　1.采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白印迹法（WB），证明提取的囊泡主要为外泌体。<br>　　2.相对于未感染BCG的巨噬细胞的外泌体，感染的巨噬细胞释放的外泌体展现出抑制感染的巨噬细胞炎症细胞因子分泌的特性，并且这种特性可以被外泌体抑制剂GW4869抑制。<br>　　3.通过对外泌体微小核糖核酸（microRNA）进行测序，结合火山图和热图分析，发现感染的巨噬细胞来源的外泌体中miR-146a-5p表达水平显著上调。<br>　　4.相较于未感染BCG的巨噬细胞外泌体，感染BCG的巨噬细胞外泌体中miR-146a-5p表达水平显著升高。同时，在GSE116542数据集和患者血浆外泌体中发现该miRNA均高表达。<br>　　5.转染 miR-146a-5p inhibitor 后，感染 BCG 的巨噬细胞miR-146a-5p低表达，且炎症因子分泌和杀菌活性有所恢复<br>　　6. Transwell共培养试验和外泌体孵育试验研究结果显示，相对于上层细胞转染NC-inhibitor，转染miR-146a-5p inhibitor的上层细胞不仅使下层细胞胞内miR-146a-5p下调，而且炎症因子分泌增多和杀菌活性增强。<br>　　7.外泌体孵育试验研究结果显示，相对于转染NC-inhibitor，转染miR-146a-5p inhibitor的细胞所分泌的外泌体可以使受体细胞杀菌活性增强。<br>　　8. Transwell 共培养试验和外泌体孵育试验研究结果显示miR-146a-5p可以结合IRAK1和TRAF6，调控IRAK1-TRAF6-NF-κB信号通路。<br>　　结论：<br>　　miR-146a-5p在结核分枝杆菌感染的细胞内及其分泌的外泌体中水平增高；感染结核分枝杆菌的巨噬细胞通过自分泌途径经外泌体介导miR-146a-5p抑制受体巨噬细胞炎症细胞因子分泌的能力；miR-146a-5p通过调控IRAK1-TRAF6-NF-κB信号通路调节受体巨噬细胞炎症细胞因子分泌和杀菌活性。