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摘要目的：<br>　　香豆素具有抗炎、抗氧化、抗凝血的药理活性。香豆素在治疗剂量下通常是安全的。然而，急性或高剂量服用香豆素可产生肝脏毒性。香豆素是Cyp2a5（CYP2A6）的特异性底物，其在小鼠体内可被代谢为7-羟基香豆素从而减轻肝脏毒性。Cyp2a5是细胞色素P450（CYPs）的重要成员，在外源物代谢中具有重要作用。研究显示，一些时钟基因和核受体能够调控Cyp2a5的表达。Rev-erbα是核受体超家族的成员，也是生物钟系统中可受配体调节的转录抑制因子。Rev-erbα也被认为是药物代谢酶基因的重要调节因子。然而，目前尚不清楚Rev-erbα对Cyp2a5和香豆素药动学及肝毒性的调控作用。本论文旨在研究核受体Rev-erbα调节Cyp2a5的表达及调控香豆素药动学及肝毒性的潜在作用，并探讨其潜在的作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.以野生型小鼠和Rev-erbα敲除鼠为研究对象，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹技术（Westernblotting），分别检测小鼠肝脏、肾脏和小肠组织中Cyp2a5的mRNA和蛋白。同时采用体外肝微粒体孵育实验，对野生型小鼠和Rev-erbα敲除鼠肝脏组织中Cyp2a5的代谢活性进行评价。<br>　　2.以野生型小鼠为研究对象，通过腹腔注射给予小鼠150mg/kg的香豆素。采用ALT和AST检测试剂盒分别检测给药后不同时间点（0h、2h、6h、12h、24h和36h）的血浆ALT和AST水平，考察不同时间点香豆素诱导肝毒性的强弱。<br>　　3.以野生型小鼠和Rev-erbα敲除鼠为研究对象，通过腹腔注射给予小鼠150mg/kg的香豆素。采用ALT和AST检测试剂盒分别检测给药后12h的血浆ALT和AST水平；采用Hamp;E染色技术对给药后12h的肝组织损伤程度进行分析。<br>　　4.以野生型小鼠和Rev-erbα敲除鼠为研究对象，对香豆素的药代动力学进行研究。采用LC-MS/MS法测定给药后不同时间（5min、15min、30min、60min、120min）血浆及（30min、60min和120min）肝脏中香豆素及其代谢物7-羟基香豆素的浓度。基于非房室模型，对血药浓度-时间曲线进行拟合，获得香豆素在野生型小鼠和Rev-erbα敲除鼠中的药动学参数。<br>　　5.采用JetPRIME?转染试剂盒，将siRev-erbα或Rev-erbα质粒转染于小鼠肝癌细胞（Hepa-1c1c7）和人肝癌细胞（HepG2）中；采用RT-qPCR和Westernblotting技术检测细胞中Rev-erbα和Cyp2a5的mRNA和蛋白表达。<br>　　6.构建Cyp2a5启动子和Tfd启动子的荧光素酶报告系统，探究Tfd在Rev-erbα调控Cyp2a5基因表达中的介导作用。<br>　　结果：<br>　　1.Rev-erbα敲除导致Cyp2a5表达和活性增强。<br>　　为了确定Rev-erbα对Cyp2a5的调控作用，我们分析了Rev-erbα敲除鼠和野生型小鼠肝脏、肠和肾中Cyp2a5的表达。Rev-erbα敲除鼠肝脏、肠和肾中Cyp2a5mRNA表达显著增加（p＜0.05）。与mRNA水平变化一致，Rev-erbα敲除鼠肝脏中Cyp2a5蛋白表达显著上调（p＜0.05）。此外，体外肝微粒体孵育实验显示，香豆素（Cyp2a5的特异性底物）在Rev-erbα敲除鼠肝微粒体中的代谢显著增强（p＜0.05）。以上数据表明Rev-erbα对Cyp2a5的表达和活性具有负向调控作用。<br>　　2.香豆素诱导的肝毒性具有时间依赖性。<br>　　以野生型小鼠为研究对象，通过腹腔注射给予150mg/kg的香豆素从而诱导小鼠肝毒性。香豆素注射后的12和24h可观察到明显的肝损伤（基于血浆ALT和AST水平）。当注射时间≥36h时，香豆素导致的肝毒性减弱，这表明香豆素诱导的肝毒性在体内有一个自然恢复过程。由此可知，香豆素导致的肝毒性具有时间依赖性。<br>　　3.Rev-erbα缺失通过上调小鼠Cyp2a5的表达来降低香豆素诱导的肝毒性。<br>　　在ZT22，腹腔注射给予Rev-erbα基因敲除鼠和野生型小鼠150mg/kg的香豆素，考察香豆素对两种小鼠的肝毒性。结果显示，与野生型小鼠相比，Rev-erbα敲除鼠血浆中ALT和AST水平显著降低（p＜0.05）。肝组织病理学分析显示，与野生型小鼠相比，Rev-erbα敲除鼠的肝脏病变（变性、炎性细胞浸润）减轻，病理学评分显著降低（p＜0.05）。这些结果表明，Rev-erbα的敲除降低了香豆素诱导的肝毒性。另外，我们发现，与野生型小鼠相比，Rev-erbα敲除鼠肝脏中Cyp2a5的mRNA和蛋白表达均明显上调。综上所述，Rev-erbα缺失可能上调小鼠Cyp2a5的表达来降低香豆素诱导的肝毒性。<br>　　4.Rev-erbα调控香豆素的代谢和药动学。<br>　　以野生型小鼠和Rev-erbα敲除鼠为研究对象，测定给药后不同时间血浆及肝脏中香豆素及其代谢物7-羟基香豆素的浓度。与野生型小鼠相比，Rev-erbα敲除鼠血浆和肝脏中香豆素浓度显著下降（p＜0.05），同时，香豆素的AUC（即药-时曲线下面积）显著减少（p＜0.05）。相反，Rev-erbα敲除鼠中香豆素的代谢物7-羟基香豆素（香豆素经Cyp2a5代谢为7-羟基香豆素而解毒）的血浆以及肝脏暴露量均显著增加（p＜0.05）。这些结果表明，Rev-erbα敲除导致香豆素代谢增强。综上所述，Rev-erbα通过调控香豆素的代谢从而改变其药代动力学。<br>　　5.Rev-erbα负向调控细胞中Cyp2a5的表达。<br>　　在Hepa-1c1c7和HepG2细胞中，高表达Rev-erbα（REV-ERBα）后，Cyp2a5的mRNA和蛋白表达显著降低（p＜0.05）。与之相反，敲低Rev-erbα（REV-ERBα）后，Cyp2a5的mRNA和蛋白表达显著增加（p＜0.05）。以上结果表明，Rev-erbα在体外细胞中负向调控Cyp2a5mRNA和蛋白的表达。<br>　　6.Tfd介导Rev-erbα对Cyp2a5的负向调控。<br>　　双荧光素酶报告基因实验显示，高表达Rev-erbα导致Cyp2a5启动子活性增强。而Tfd剂量依赖性地激活Cyp2a5启动子的转录活性。此外，Rev-erbα抑制Tfd的活性。因此，我们推测Tfd可能是Rev-erbα调控Cyp2a5转录和表达的中间调因子。<br>　　结论：<br>　　在mRNA、蛋白和活性水平揭示了核受体Rev-erbα负向调控小鼠Cyp2a5的表达，从而影响香豆素的代谢和肝毒性。另外，本研究揭示了Tfd在介导Rev-erbα调控Cyp2a5过程中的潜在作用。