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摘要【目的】<br>　　胃癌（GastricCancer,GC）是全球第五大最常见的恶性肿瘤，其死亡率为癌症第三位。胃癌的发病机制及病因目前尚未十分明确。临床上治疗胃癌的常用方法为手术切除结合放疗、化疗、靶向治疗。尽管化疗在治疗胃癌方面取得了显著的成效，但仍存在许多未解决的问题。由于化疗药物的副作用大而且易耐药，导致其治疗效果不理想，甚至失败。因此，寻求一种廉价、副作用小、对胃癌有显著疗效果的药物成为开发抗肿瘤药物的新策略。Diosmetin在不同的肿瘤细胞中呈现良好的抗肿瘤活性，而其相应的分子机制也各不相同。本研究以胃癌细胞HGC-27为研究对象，探讨diosmetin对HGC-27的抗肿瘤疗效及其相关机制，以期为胃癌的治疗提供理论依据和实验基础。<br>　　【方法】<br>　　采用不同浓度diosmetin（0、2.5、5、10、20?g/ml）处理人胃癌细胞HGC-27，采用细胞毒性试剂盒MTS法检测其对细胞毒性的影响；平板克隆形成实验检测diosmetin对HGC-27细胞增殖能力的影响；通过鬼笔环肽和α-Tubulin染色使细胞微管微丝着色，利用免疫荧光显微镜观察diosmetin对其形态影响；通过激光共聚焦荧光显微镜观察Cleavedcaspase-3蛋白表达及其定位；采用划痕实验、Transwell迁移实验检测diosmetin对HGC-27细胞迁移能力的影响；周期检测试剂盒单染后流式检测diosmetin对HGC-27细胞周期变化的情况；采用凋亡检测试剂盒双染后用流式检测diosmetin对HGC-27细胞凋亡率的情况；Tunel染色共聚焦显微镜观察diosmetin诱导HGC-27细胞凋亡的情况；JC-1试剂盒染色后流式检测diosmetin对HGC-27细胞线粒体膜电位的影响；通过Western-Blot检测相关凋亡蛋白、PI3K/Akt/FoxO1、自噬标志蛋白及MAPK蛋白的变化情况。<br>　　【结果】<br>　　1.Diosmetin影响胃癌细胞的生物学行为<br>　　不同浓度diosmetin（0、2.5、5、10、20?g/mL）分别处理HGC-27细胞12h、24和48h，MTS法检测diosmetin对HGC-27细胞毒性的影响，diosmetin组细胞生长抑制率显著升高，并呈浓度依赖性。平板克隆形成实验显示，diosmetin处理细胞48h后，HGC-27细胞集落数量及大小显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）免疫荧光显微镜显示，与对照组比较，diosmetin组细胞核形态明显变化，细胞核不完整、浓缩甚至溶解。细胞骨架微丝排列紊乱并出现局部呈现溶解。<br>　　划痕试验显示，对照组迁移率高达60%以上，diosmetin处理HGC-27细胞48h后迁移率显著降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。Transwell迁移试验显示diosmetin处理HGC-27细胞48h后，迁移细胞数量明显减少。<br>　　2.Diosmetin剂量依赖性地诱导周期阻滞及线粒体凋亡<br>　　不同浓度diosmetin处理HGC-27细胞48h,Cleavedcaspase-3标记后通过激光共聚焦荧光显微镜观察，随着diosmetin浓度逐渐升高，Cleavedcaspase-3的荧光信号显著增强。流式凋亡试剂盒双染后流式细胞术显示，与对照组相比，细胞凋亡早期凋亡及总凋亡率增加（P＜0.05）。线粒体膜电位荧光染色显示，红色荧光所细胞比例随着药物浓度升高而降低，而绿色荧光所占细胞比例明显增加。流式周期结果显示，与对照相比，随着diosmetin浓度的增加而升高，G2/M期细胞比例显著增多，细胞发生G2/M期阻滞。差异有统计学意义（P＜0.05）。Western-blot检测发现，diosmetin显著能下调HGC-27细胞的Caspase-9、Caspase-3及PARP总蛋白的表达，而上调Cleavedcaspase-9、Cleavedcaspase-3及CleavedPARP蛋白的表达，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　3.Diosmetin抑制PI3K/Akt/FoxO1通路诱导胃癌细胞发生凋亡。<br>　　不同浓度Diosmetin处理HGC-27细胞48h后,Western-blot检测PI3K/Akt/FoxO1相关通路蛋白显示，与对照组相比，随着diosmetin浓度升高，p-PI3K、p-Akt及p-FoxO1蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而PI3K、Akt及FoxO1总蛋白水平基本保持不变。为了进一步探究PI3K/Akt/FoxO1通路与细胞凋亡的关系，我们使用了Akt通路激活剂（IGF-1）。IGF-1预处理后提高了diosmetin处理HGC-27细胞中p-Akt及p-FoxO1蛋白的表达水平及降低了CleavedPARP、Cleavedcaspase-3、p-Bcl2、Bax、Bak促凋亡蛋白水平（P＜0.05）。流式凋亡试剂盒双染后流式细胞术显示，IGF-1预处理后明显降低了diosmetin处理HGC-27细胞后细胞凋亡率（P＜0.05）。一步法Tunel染色显示，diosmetin处理后细胞红色荧光明显增多，而经IGF-1预处理后红色荧光显著减少。通过激光共聚焦荧光显微镜观察发现，与diosmetin组相比，IGF-1+diosmetin组Cleavedcaspase-3荧光强度明显降低。<br>　　4.Diosmetin诱导胃癌细胞保护性自噬<br>　　不同浓度diosmetin处理HGC-27细胞48h后,Western-Blot检测发现，药物组LC3Ⅱ蛋白表达水平增加及p62蛋白水平降低，与对照相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。为了进一步探究自噬的作用，我们使用了自噬抑制剂氯喹（Chloroquine）。氯喹预处理后显著提高了diosmetin处理细胞后LC3Ⅱ及p62蛋白水平。Western-blot检测发现，与diosmetin组比较，chloroquine+diosmetin组显著上调了促凋亡蛋白CleavedPARP、Cleavedcaspase-3、Bax及下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；流式凋亡试剂盒双染后流式细胞术显示,chloroquine+diosmetin组细胞凋亡率显著升高，与diosmetin组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）<br>　　5.Diosmetin激活MAPK/JNK诱导胃癌细胞保护性自噬<br>　　不同浓度diosmetin处理HGC-27细胞48h后,Western-blot检测发现，与对照组相比，随着diosmetin浓度升高，p-ERK、p-p38及p-JNK蛋白水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。而ERK、p38及JNK总蛋白水平基本保持不变。我们使用了JNK抑制剂SP600125,Western-blot检测表明，与diosmetin组比较，SP600125+diosmetin组促凋亡蛋白CleavedPARP及Cleavedcaspase-3的表达显著上调，自噬蛋白LC3Ⅱ的表达降低及p62蛋白的表达升高。<br>　　【结论】<br>　　1.Diosmetin抑制胃癌细胞HGC-27的增殖、迁移，改变细胞骨架的形态结构以及其分布；<br>　　2.Diosmetin诱导胃癌细胞HGC-27线粒体凋亡及G2/M期阻滞；<br>　　3.Diosmetin抑制PI3K/Akt/FoxO1通路，促进胃癌细胞HGC-27发生凋亡；<br>　　4.Diosmetin诱导胃癌细胞HGC-27的保护性自噬；<br>　　5.Diosmetin通过激活MAPK/JNK信号通路，促进胃癌细胞HGC-27的保护性自噬。