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摘要【目的】<br>　　1.探讨巨噬细胞炎症性极化与重症手足口病的相关性。<br>　　2.探讨巨噬细胞是否是EV71感染所致炎症因子风暴的主要炎症因子来源细胞，并验证IFN-γ是否能作为HFMD重症发展早期的预测因子。<br>　　【方法】<br>　　1.建立小鼠HFMD重症模型：分别向3、6、9日龄的小鼠中腹腔注射EV71病毒液，对照组注射同等剂量的DMEM培养基。注射病毒液或者培养基后连续观察小鼠的生存情况以及症状健康评分情况，并选取最佳日龄小鼠模型组并开展后续动物实验。<br>　　2.动物模型中初步明确巨噬细胞与重症HFMD炎症因子风暴发生相关性<br>　　(1)3日龄乳鼠感染EV71后，濒死的小鼠立即进行断颈处死，其它小鼠在感染14天后按同样方法处理并收集肺、骨骼肌等组织器官。使用HE染色方法观察肺及骨骼肌组织的病理变化，确认重症HFMD小鼠组织部位发生炎症损伤。<br>　　(2)使用荧光定量PCR（qPCR）检测IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-1β在肺、骨骼肌组织中的表达变化，以确认重症HFMD炎症因子风暴的发生。<br>　　(3)采用免疫组化方法（IHC）检测巨噬细胞的标记物（F4/80）在肺及骨骼肌组织中的表达情况，确认巨噬细胞与重症HFMD组织部位炎症损伤有关。<br>　　3.体外细胞实验进一步明确EV71感染导致的巨噬细胞炎症性极化是炎症因子风暴发生的重要原因。<br>　　(1)分离腹腔来源的巨噬细胞，使用不同剂量EV71病毒液攻毒后观察细胞形态变化，验证EV71感染与巨噬细胞极化相关性。<br>　　(2)使用上述巨噬细胞进行体外实验。设置空白组（对照组）、EV71组、IFN-γ+EV71组，分别在不同时间段观察各细胞组形态变化。利用qPCR检测EV71感染组中不同时间段（6h、12h、24h、48h）炎症因子（IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6）的mRNA表达变化，进一步验证巨噬细胞是否为EV71感染所致重症HFMD中过量炎症因子的主要分泌细胞。<br>　　(3)使用ELISA方法检测EV71组、IFN-γ+EV71组中不同时间段炎症因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的表达水平变化；并采用Spearman相关性分析验证在IFN-γ+EV71组中不同时间内炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β与IFN-γ的相关性，初步筛选在HFMD临床重症发生早期中有预测价值的炎症因子。<br>　　4.进一步验证IFN-γ在重症HFMD发展早期的作用。利用ELISA检测3日龄乳鼠在接种EV71病毒后1周内每天IFN-γ血清学水平变化，明确IFN-γ是否能作为HFMD重症发展早期的预测指标。<br>　　【结果】<br>　　1.3日龄乳鼠接种EV71病毒后第2天，表现为嗜睡、活动量少等轻症表现，而在第3天小鼠陆续出现弓背、后肢无力或瘫痪等重症表现，后续全部死亡。EV71感染6日龄小鼠后期只有2只小鼠死亡，而9日龄感染小鼠中刚开始出现活动量减少、精神状态萎靡，随后症状恢复，最后与对照组小鼠无差别。遂选取3日龄乳鼠作为本课题中的小鼠模型对象，并且以接种EV71病毒后第3天的小鼠模型作为重症组、第2天的小鼠模型作为轻症组，正常小鼠作为对照组。<br>　　2.HE染色观察重症组的肺、骨骼肌组织，结果显示组织均严重损伤并伴有大量炎症细胞浸润；免疫组化检测肺及骨骼肌组织中巨噬细胞标记物（F4/80）的表达，较轻症组而言，重症组的肺及骨骼肌组织中出现明显的棕褐色颗粒物；qPCR方法检测动物模型各组中肺及骨骼肌组织中IFN-γ、IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平，重症组中炎症因子较轻症组及对照组明显升高（P＜0.05）。<br>　　3.EV71攻毒腹腔来源的巨噬细胞，结果显示随着病毒滴度增加，巨噬细胞表现为伸出伪足，并随时间变化伪足更明显。表明EV71感染时可诱导巨噬细胞炎症型极化（Ⅰ型）。<br>　　4.细胞实验中，分别在6h、12h、24h观察到IFN-γ+EV71组及EV71组中巨噬细胞的形态，较对照组而言，均伸出伪足。随时间变化IFN-γ+EV71组中细胞伪足较EV71组更明显。qPCR检测各组中24h时间点的细胞分型标志物iNOS及Arg-1表达，结果显示IFN-γ+EV71组及EV71组两组中均以iNOS升高为主，前者较后者表达明显（P＜0.05）。进一步表明EV71感染时诱导巨噬细胞Ⅰ型极化。<br>　　5.qPCR检测在EV71组细胞中不同时间段炎症因子的mRNA表达变化，实验结果显示EV71感染导致巨噬细胞分泌大量IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子。进一步验证了巨噬细胞是EV71感染重症HFMD中过量炎症因子主要的分泌细胞。<br>　　6.ELISA方法检测IFN-γ+EV71组及EV71组分别在6h、12h、24h、48h中炎症因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的表达水平，结果显示炎症因子随时间进展，IFN-γ+EV71组中炎症因子表达较与EV71组显著升高（P＜0.01）。Spearman相关性分析，结果表明IFN-γ+EV71组中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β在不同时间段的表达与IFN-γ成正相关性。初步筛选出炎症因子IFN-γ在HFMD重症发生的早期有预测价值。<br>　　7.ELISA检测3日龄乳鼠在接种EV71病毒后1周内每天的IFN-γ血清学水平变化结果显示：在感染后第3天，IFN-γ血清学水平出现急剧升高(67.04pg/ml)，相对应的表现出弓背、后肢瘫痪等重症表型。表明炎症因子IFN-γ可作为重症HFMD发展早期的预测因子。<br>　　【结论】<br>　　1.重症HFMD小鼠炎症损伤部位有大量巨噬细胞浸润以及炎症因子大量表达，初步提示巨噬细胞炎症浸润与EV71感染所致HFMD重症发生密切相关。<br>　　2.EV71感染可直接促进巨噬细胞炎症型极化并释放大量炎症因子（IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-1β），且IL-6、TNF-α、IL-1β的表达与IFN-γ呈正相关性，进一步提示巨噬细胞炎症型极化是EV71感染所致炎症因子风暴中炎症因子的主要来源，并且IFN-γ被筛选为重症HFMD发展早期中有预测价值的炎症因子。<br>　　3.小鼠血清IFN-γ水平变化与EV71感染小鼠表型恶性进展相关，并提示IFN-γ可作为重症HFMD发展早期的预测因子。