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摘要糖尿病是一种以高血糖为特征的严重慢性代谢性疾病，其发病机制与胰岛素抵抗和胰岛功能障碍密切相关。胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）是2型糖尿病发展的重要驱动因素。截止2021年，2型糖尿病（Type2 diabetic mellitus，T2DM）占全球糖尿病病例的96%以上。持续的高血糖水平会造成全身血管损伤，并能引起糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等一系列并发症，严重威胁患者身体健康，降低生活质量。因此，T2DM的防控和治疗刻不容缓。研究表明，T2DM具有慢性低度炎症和代谢功能障碍等特征，炎症反应可能通过引起胰岛素抵抗而导致T2DM的发生，并且在高血糖的情况下会加剧，从而促进糖尿病的长期并发症。由此可知，炎症途径和胰岛素功能调节可能是预防和控制糖尿病及相关并发症策略的重要切入点。<br>　　研究显示，规律运动可有效调节T2DM患者糖脂代谢异常和胰岛素抵抗，降低内脏脂肪组织含量、改善体成分及生活质量，在控制血糖、减少心血管危险因素和死亡风险等方面效果显著，是预防T2DM及其健康管理的有效干预方法。课题组前期研究显示，中等强度运动能够通过调节脂肪组织中巨噬细胞来源的外泌体miRNA从而发挥改善T2DM的作用，然而运动通过脂肪组织改善T2DM胰岛素敏感性的具体作用机制尚未完全明晰。基于以上背景，我们拟以运动诱导的巨噬细胞来源外泌体为切入点，探讨其在运动改善T2DM胰岛素敏感性中的作用机制，以期挖掘出运动防治T2DM的有效作用靶点，为科学运动防治2型糖尿病提供实验依据和临床参考。<br>　　实验一：运动调节巨噬细胞极化对T2DM小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的改善作用<br>　　研究目的：探讨不同强度跑台运动对T2DM小鼠脂肪组织炎症、胰岛素敏感性和脂代谢的改善作用，并分析不同强度运动改善T2DM的可能作用机制。<br>　　研究方法：8周龄SPF级自发性肥胖型2型糖尿病动物模型雄性db/db（BSK. Cg-Dock7m+/+ Leprdb/JNju）小鼠32只，随机分为：2型糖尿病组（M组），小强度跑台运动组（LE组）、中等强度跑台运动组（ME组）、大强度跑台运动组（HE组），每组8只。同品系非糖尿病SPF级db/m小鼠8只作为正常对照组（NC组）。LE组、ME组和HE组先进行一周强度递增的跑台运动训练，随后进行为期8周的跑台运动训练，每周5次，每次30min。8周干预期间的称量体重、饮水量、进食量，测量空腹血糖。干预结束后检测各组小鼠IPGTT和IPITT变化，取材后称量各组小鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织重量。PCR实验检测白色脂肪组织中F4/80、Arg1、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP1、IL-10、PPARγ、GLUT4、ADPN、UCP1、IRS1的基因表达水平，Western blot检测白色脂肪组织中Arg1、iNOS、PPARγ、GLUT4、ADPN、UCP1、TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平。HE染色检测白色脂肪组织中脂肪细胞形态变化，免疫荧光检测各组白色脂肪组织中M1型和M2型巨噬细胞占比。<br>　　研究结果：干预8周后，与M组比较，LE组、ME组、HE组体重、空腹血糖均显著降低（P＜0.01）；与LE组相比，ME组体重显著降低（P＜0.01）。与M组比较， ME组在第2-8周日均摄食量和饮水量均显著下降（ P＜0.05或P＜0.01）。随着干预时间的延长，LE组、ME组和HE组日均摄食量和饮水量总体呈下降趋势，ME组效果最显著。各组小鼠IPGTT曲线下面积结果显示，与M组比较，ME组和HE组IPGTT曲线下面积均显著下降（P＜0.01）。各组小鼠IPITT曲线下面积结果显示，与NC组比较，各组小鼠IPITT曲线下面积均显著上升（P＜0.01）。与M组比较，LE组、ME组和HE组IPITT曲线下面积均显著下降（P＜0.01）。<br>　　流式细胞术结果显示，与NC组比较， M组总巨噬细胞比例显著升高（P＜0.01），提示机体存在大量炎症。与M组比较，ME组总巨噬细胞比例显著降低（P＜0.01）。Elisa和生化结果显示，与M组比较，LE组、ME组、HE组TC和LDL-C水平均显著下降（P＜0.05或P＜0.01），ME组TG水平显著降低（ P＜0.05）， HDL-C水平显著升高（ P＜0.05）， HE组LDL-C水平显著下降（P＜0.01），HDL-C水平显著上升（P＜0.05）。<br>　　PCR结果显示，与M组比较，LE组F4/80、iNOS、TNF-α、MCP1的mRNA表达水平均显著下降（P＜0.05或P＜0.01），ME组F4/80、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP1的 mRNA表达水平均显著降低（ P＜0.01）， Arg1、PPARγ、GLUT4、ADPN、UCP1、IL-10的 mRNA表达水平均显著升高（ P＜0.05或P＜0.01），HE组F4/80、iNOS、TNF-α、IL-6、MCP1的mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），Arg1、PPARγ、UCP1、IL-10、IRS1的 mRNA表达水平均显著上升（P＜0.01）。WB结果显示，与M组比较，LE组IL-1β的蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），ME组iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），Arg1、PPARγ、GLUT4、ADPN、UCP1的蛋白表达水平均显著上升（P＜0.05或P＜0.01），HE组TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　实验二：运动诱导的脂肪组织巨噬细胞外泌体改善T2DM小鼠胰岛素敏感性的作用机制<br>　　研究目的：探讨不同强度跑台运动诱导的脂肪组织巨噬细胞来源外泌体改善T2DM小鼠脂肪组织胰岛素敏感性和炎症的具体作用靶点，并分析其可能作用通路和机制。<br>　　研究方法：取小鼠附睾脂肪，生理盐水漂净，剪碎，研磨后转移至匀浆管。胶原酶Ⅱ于37℃恒温孵育箱中消化15min，然后离心10min去除上层油脂及上清液顶层的原代脂肪细胞。然后加入500μL0.1%的I型胶原酶，吹打混匀，放在37℃水浴锅中消化。<br>　　研究结果：综合电镜、NTA、WB结果证明提取的是脂肪组织巨噬细胞来源的外泌体。miRNA高通量测序结果显示，通过PCR验证我们发现，miRNA-10a-5p为差异最显著且趋势与测序结果相符合的miRNA。miRNA热图分析发现，与M组比较，ME组miR-10a-5p显著上调。<br>　　实验三：运动诱导的脂肪组织巨噬细胞外泌体对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的调控作用<br>　　研究目的：探讨不同强度跑台运动诱导的脂肪组织巨噬细胞外泌体对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的调控作用，并分析其可能的作用靶点、通路和机制。<br>　　研究方法：3T3-L1前脂肪细胞进行复苏培养和传代，然后用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），地塞米松（DEX）和胰岛素等进行分化诱导，并对诱导后的细胞进行油红O染色鉴定。用地塞米松建立IR模型并进行模型验证。CCK-8法检测细胞增殖情况，Transwell检测细胞迁移情况，GOD-POD法检测葡萄糖消耗量，PCR法检测细胞miR-10a-5p和靶基因ATF2的基因表达水平，PI3K、AKT基因表达水平，巨噬细胞相关指标F4/80、iNOS和炎症因子相关指标TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、MCP1的基因表达水平，以及胰岛素敏感性相关指标PPARγ、GLUT4、ADPN、UCP1、IRS1的基因表达水平。Western blot法检测ATF2、P-ATF2和PI3K、AKT及其磷酸化的蛋白表达水平，巨噬细胞相关指标F4/80、iNOS和炎症因子相关指标TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、MCP1的蛋白表达水平，以及胰岛素敏感性相关指标PPARγ、GLUT4、ADPN、UCP1、IRS1的蛋白表达水平。<br>　　研究结果：与M组比较，LE-Exos组、ME-Exos组和HE-Exos组细胞活性显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。与M组比较，ME-Exos组和HE-Exos组葡萄糖消耗量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　实验四：miR-10a-5p对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的调控作用<br>　　研究目的：探讨miR-10a-5p对脂肪细胞胰岛素抵抗和炎症的改善作用。<br>　　研究方法：将3T3-L1脂肪细胞分组为对照组（NC组）、IR模型组（M组）、IR模型组+ miR-10a-5p inhibitor组（inhibitor组）、IR模型组+miR-10a-5p inhibitor NC组（inhibitor NC组）、IR模型组+miR-10a-5p mimic组（mimic组）、IR模型组+miR-10a-5p mimic NC组（mimic NC组）。<br>　　研究结果：与 M组比较， mimic组和 mimic NC组细胞活性显著降低（P＜0.01）。与M组比较，inhibitor组葡萄糖消耗量均显著升高（P＜0.01）。与M组比较， mimic组TG含量显著降低（P＜0.01）。<br>　　研究结论：运动可促进ATM-Exos中miR-10a-5p的释放，抑制其靶基因ATF2的表达，进而激活PI3K/AKT信号通路，调节脂肪组织巨噬细胞极化状态，减轻脂肪组织炎症，从而改善T2DM胰岛素抵抗。