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摘要赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由多种青霉属和曲霉属的真菌产生的有毒性的代谢产物，广泛存在于谷物、饲料、食品中。目前，OTA的检出率比较高，但绝大部分低于限量标准。研究表明 OTA 产生毒性的主要靶器官是肾脏，在所有动物中均能产生肾毒性，因此 OTA 的污染对人类和动物的健康构成严重的威胁。慢性肾病（Chronic kidney disease，CKD）是一种渐进性慢性疾病，具有很高的发病率和死亡率，并且近几年CKD整体发病趋势逐年增加。CKD向终末期肾病的进展伴有肾纤维化过程的改变，转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）被普遍认为是通过激活其下游细胞增殖、分化和迁移通路参与肾纤维化的。现有的 OTA 限量标准主要是基于健康动物机体中进行探究，但有关机体处于亚健康或疾病状态下对 OTA 的抵抗力能否达到健康状态下的水平鲜有研究报道。考虑到 OTA 的高检出率和低污染水平以及CKD的高发病率，围绕低水平OTA污染对CKD的作用开展研究至关重要。阿霉素（Adriamycin，ADR）和环孢霉素A（Cyclosporine A，CSA）诱导的慢性肾小球肾病模型和慢性肾小管肾病模型是被公众接受且稳定的肾病模型。因此本研究选用ADR或CSA诱导的两种小鼠慢性肾病模型和两种肾细胞损伤模型，探究低水平OTA对 ADR 和 CSA 诱导的肾毒性和肾细胞毒性的影响，从而为提高食品、饲料的 OTA限量标准提供试验依据。本研究将 TGF-β/SMAD2/SMAD3 信号通路作为研究肾脏纤维化的靶点，旨在为缓解肾纤维化和对慢性肾病的治疗及预防提供一定的试验基础。本研究主要从以下两个方面进行：<br>　　试验一、低水平赭曲霉毒素 A 对阿霉素诱导的肾小球损伤和肾小球系膜细胞毒性的影响<br>　　本试验旨在探究在ADR成功构建慢性肾小球肾病模型基础上，低水平OTA暴露对ADR诱导的肾小球损伤的影响。体内试验结果表明，低水平OTA单独处理并不影响小鼠生长性能，但能明显导致 ADR 小鼠体重增长放缓。进一步研究发现，低水平OTA能增加ADR小鼠肾脏指数，提高ADR小鼠血清中肌酐和尿素氮水平，且较ADR组小鼠更显著。Hamp;E 染色结果观察到 OTA+ADR 组的肾小球结构被破坏消失而被玻璃样物质取代，表明低水平的OTA能够加剧ADR诱导的肾脏组织损伤，马松染色结果显示 OTA+ADR 组的纤维化相关蛋白（胶原纤维）蓝染区域较大，表明低水平的OTA能够加剧ADR诱导的肾小球硬化。同时，免疫印迹结果显示OTA+ADR联合暴露组小鼠肾脏纤维化因子α-SMA和Vimentin的蛋白表达水平也较ADR组小鼠进一步提高，表明低水平的OTA暴露可以促进ADR诱导的肾损伤和肾脏纤维化。<br>　　体外试验首先检测不同浓度OTA和ADR对HMC细胞活力的影响，选择无细胞毒性的OTA（2.5 μM）和有细胞毒性的ADR（0.5 μM）进行后续试验。MTT 结果显示，低水平的OTA能明显加强ADR对HMC的细胞毒性。免疫印迹试验及间接免疫荧光试验结果表明，低水平的OTA能够进一步上调ADR诱导的HMC细胞中α-SMA和Vimentin蛋白表达及胞内分布。此外，低水平的OTA也促进了ADR诱导的TGF-β、P-SMAD2、P-SMAD3的蛋白表达水平。接下来，通过使用SMAD2的特异性抑制剂 SB431542 和 SMAD3 的特异性抑制剂 SIS3 分别处理 HMC 细胞，结果显示抑制TGF-β/SMAD2/SMAD3信号通路后，OTA和ADR诱导的α-SMA和Vimentin的表达被阻滞。综上所述，低水平OTA通过激活TGF-β/SMAD2/SMAD3信号通路加剧ADR诱导的肾小球损伤和肾小球系膜细胞毒性。<br>　　试验二、低水平赭曲霉毒素A对环孢霉素A诱导的肾小管损伤和肾小管上皮细胞毒性的影响<br>　　本试验旨在探究在CSA成功构建慢性肾小管肾病模型基础上，低水平OTA暴露对CSA诱导的肾小管损伤的影响。体内试验结果表明低水平OTA单独处理组对小鼠的生长性能无显著影响，而能够导致 CSA 小鼠体重增长放缓，但对肾脏指数没有显著影响。进一步研究发现，低水平OTA能够明显提高CSA小鼠的血清肌酐和血尿素氮水平。Hamp;E染色观察到OTA+CSA组出现肾小管细胞破裂、空泡化和肾小管扩张，结果表明低水平OTA能够加剧CSA诱导的肾脏组织损伤，马松染色结果发现低水平OTA扩大了CSA小鼠肾脏中的胶原纤维蓝染区域，能够加剧CSA诱导的肾间质纤维化。此外，免疫印迹结果显示OTA+CSA联合暴露组小鼠肾脏纤维化因子α-SMA和Vimentin的蛋白表达水平显著上调了，表明低水平的OTA暴露可以加剧CSA诱导的肾损伤和肾脏纤维化。<br>　　体外试验首先检测不同浓度OTA和CSA对HK-2细胞活力的影响，选择无细胞毒性的OTA（2.5 μM）和有细胞毒性的 CSA（10 μg/mL）进行后续试验。并且 MTT结果显示，低水平OTA能够明显加剧CSA对HK-2的细胞毒性。免疫印迹和间接免疫荧光试验结果表明，低水平OTA能够进一步上调CSA诱导的HK-2细胞中α-SMA和Vimentin蛋白表达及胞内分布。此外，低水平OTA也提高了CSA诱导的TGF-β、P-SMAD2、P-SMAD3的蛋白表达。紧接着，使用特异性SMAD2抑制剂SB431542和特异性 SMAD3 抑制剂 SIS3 分别在 HK-2 细胞上进行处理，结果显示抑制 TGF-β/SMAD2/SMAD3信号通路后，OTA和CSA诱导的α-SMA和Vimentin的表达被阻断。综上所述，低水平 OTA 通过进一步活化 TGF-β/SMAD2/SMAD3 信号通路加剧CSA诱导的肾小管损伤和肾小管细胞毒性。